Illumina-Eco荧光定量PCR解析
荧光定量PCR实验原理及数据分析
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SYBR Green I 染料法－－优缺点 优 点
使用方便，不必设计 复杂探针 具有价格优势
缺 点
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
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Taqman 探针法－－原理
• • • •
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SYBR Green I 染料法－－问题点与关键点
• 问题点：
– SYBR Green I 与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应 体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。
• 关键点：
– 设计合适引物，防止非特异性扩增！
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
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Taqman 探针法－－工作机理
•
拷贝数的计算：
– 待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40×稀释倍数 – 样本分子量=碱基数×324 – 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
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绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
• • 方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103；2个重复；设阴性 空白对照 • 实验步骤：提取HBV DNA；
病原体检测，疾病耐药基因研究, 药物疗效考核 遗传疾病的诊断 特定基因分析 SNP分析
分子信标
高特异性 荧光 背景低
Eco实时荧光定量PCR
热力学系统
控温元件 温度均一性 温控范围 平均升温速率 样品板 样品体积 反应时间
·专利的中空银槽和半导体 ·± 0.1℃，实际温度均一性 < 0.05℃ ·35–100℃ ·5.5℃ / 秒 ·48孔板 ·5–20μl ·用标准的定量试剂，40循环少于40分钟 ·只读熔解曲线，HRM 功能约4分钟
5个合成的基因变异型：GG,CC,TT,AA和一个 核苷酸的缺失，每个样品4个重复
Eco定量PCR仪软件界面-实验类型选择
实验设置简单直观，设置样品性质 （标准品，阴性对照，未知样品）等
反应条件设置为图形界面，温度，时间一目了然， 反应进程均在界面上显示
产品参数
仪器规格 性能 尺寸/重量
电源参数
·检测灵敏度可低至1 拷贝 ·动力学范围 > 9 logs；区分5,000 和 10,000模板拷贝，具有99%置信度 ·盖子关闭：W×D×H: 13.6 in × 12.2 in × 12.6 in ·盖子打开：W×D×H: 13.6 in × 12.2 in × 14.5 in ·重量：13.6 kg (30 lbs) ·电压：120–240 VAC = 10%；频率: 50/60 Hz = 1% ·标准电流：8A ·峰值功率：500W；标准功率：180W
的染料，均无需额外的校正 ·ROX 支持，可选用
软件
许可证 支持应用
支持数据分析
界面 数据格式
·无，网上免费升级 ·基因表达 ·基因分型 ·高分辨率熔解曲线 ·绝对定量 ·ΔΔCq 法相对定量，支持多内参基因和PCR效率校正 ·等位基因分型 ·高分辨率熔解曲线分析 ·向导式界面，样品布局和反应条件编辑简单、直观，并且常用的应用都有内置
Eco loading dock Eco plates
荧光定量pcr技术原理
荧光定量pcr技术原理荧光定量PCR技术（qPCR）是一种广泛应用于遗传学、病毒学、生物学以及医学等领域的分子生物学技术。
qPCR技术不仅能够准确快速地定量检测DNA模板，还可以检测RNA模板和蛋白质模板。
下面，将对qPCR技术的原理和步骤进行详细解释。
qPCR技术可以快速、精确地检测DNA，RNA和蛋白质等生物分子，其基本原理是通过PCR扩增反应，将DNA等靶分子浓缩，使其达到检测的限度。
同时，通过加入荧光标记的探针或引物，可以精确地记录反应的进程。
PCR反应完成后，荧光信号的变化可以直接反映出DNA分子的变化情况，进而得出浓度的定量结果。
qPCR反应主要包含两个步骤：PCR扩增基因片段和荧光信号检测。
PCR扩增基因片段的过程与普通PCR相同，但是在反应体系中加入荧光标记的探针或引物，所以荧光定量PCR反应的结果不仅表明结果是否出现，还可以定量检测出靶基因的数量。
因此，qPCR技术经常用于测定遗传性状、基因表达水平、微生物的定量，等等。
qPCR技术的优点主要体现在检测精度和灵敏度方面。
相对于传统的PCR技术，qPCR技术具有更高的检测灵敏度和更高的重复性，并且可以在较短的时间内处理大量样本；同时，qPCR技术可以在未开放区间（如DNA合成反应合成DNA的时候）检测反应的进程，这大大提高了实验的灵活性和可操作性。
2. 荧光定量PCR技术步骤（1）实验设计。
实验设计是qPCR技术的第一步，必须选择适当的引物和探针设计。
引物和探针的设计通常使用在线工具进行设计，二者均需具有较高的特异性，对非靶标序列不产生杂交效应，并且需要对目标序列具有较高的亲和性，以获得较好的扩增效果和检测结果。
（2）qPCR反应。
qPCR反应可以在各种qPCR仪器中进行。
在反应中，将提取的DNA或RNA按照设计好的引物和探针进行PCR扩增。
反应条件会因引物和探针的选择而有所不同。
反应结束后，qPCR仪器可以自动记录荧光信号变化，并计算扩增产物的数量，从而得出样品中目标序列的浓度。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
illumina测序原理
illumina测序原理illumina测序是一种分子生物技术，是人类基因组测序领域最常用的序列技术。
Illumina测序可以帮助研究人员对物种基因组进行微观上的分析，以了解物种遗传和表型的变化，以及为药物开发和临床诊断提供技术支持。
本文将介绍illumina测序的原理、技术方法以及用于探索疾病的应用。
illumina测序的原理illumina测序以能够自动分辨双链DNA的激光荧光技术为基础。
它是一种借助微孔板的半结构化的、多芯片的平台，可以同时对多条双链DNA进行高通量测序。
其基本原理是，在介质中悬浮的DNA片段会在illumina仪器上被电场热像(piezo-electric heating)做成微型沉积，然后由四种激光激发激光（excitation laser）、发射激光（emission laser）、紫外线激光（UV laser）、紫外线破坏激光（UV destruction laser）对每个沉积的微粒进行精确的检测。
illumina测序的技术方法illumina测序通常由四个步骤组成：DNA片段制备、多聚合酶链反应(PCR)、样品分配和测序读取。
1、DNA片段制备：这一步是首先利用核酸在体外产生固定大小的DNA片段，然后加入抑制剂阻止PCR反应，最后将数据存储在微孔板中。
2、多聚合酶链反应(PCR)：多聚合酶链反应(PCR)使得每个DNA 片段可以得到大量的复制，以便illumina仪器可以测试它们。
3、样品分配：在这个步骤中，借助芯片的能力，illumina测序仪可以将样品放置在固定的位置上，并精确地控制它们的移动速度和沉积位置，以实现多个样品的定位和分配。
4、测序读取：这是最后一步，也是最重要的步骤，即对每一个沉积的DNA片段序列进行精确的测序，以获得每一条双链DNA的完整序列。
illumina测序用于疾病探索illumina测序不仅应用于普通的基因组测序，还可以用于探索疾病机制，鉴定敏感性突变，并检测基因组结构变异。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的DNA扩增技术，通过检测PCR反应体系中的荧光信号实时监测DNA的合成量。
这种技术结合了传统PCR的高效性和荧光探针的高度特异性，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因定量、基因型鉴定等领域。
一、原理荧光定量PCR利用荧光信号与PCR产物数量呈正比的原理，通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化来确定反应体系中模板DNA的初始量。
在PCR反应中，荧光探针与特定的DNA序列结合，并发出荧光信号。
随着PCR反应的进行，产物数量逐渐增加，荧光信号也随之增加。
通过检测荧光信号的增长曲线，可以确定初始模板DNA的数量。
二、应用1.基因表达分析：荧光定量PCR可用于实时监测基因的表达水平，通过检测靶基因的mRNA量来研究基因在不同条件下的表达情况。
2.病原体检测：荧光定量PCR可用于快速准确地检测病原体的存在，如病毒、细菌等，对临床诊断和疾病监测具有重要意义。
3.基因定量：荧光定量PCR可用于定量分析基因拷贝数、基因表达水平等，对基因功能研究和疾病诊断有重要作用。
4.基因型鉴定：荧光定量PCR可用于检测基因型多态性，如单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失等，用于遗传学研究和个体鉴定。
三、优势与传统PCR技术相比，荧光定量PCR具有以下优势：1.高灵敏度：荧光信号与PCR产物数量呈正比，可实现低拷贝数DNA的检测。
2.高特异性：荧光探针设计精准，可准确识别靶基因序列，避免非特异性扩增。
3.实时监测：可实时监测PCR反应过程中的荧光信号，得到实时、准确的反应动态信息。
4.高准确性：荧光定量PCR结果稳定可靠，可用于定量分析和比较研究。
荧光定量PCR作为一种高效、高灵敏的DNA定量技术，在生命科学研究、临床诊断、食品安全监测等领域具有广泛应用前景。
随着技术的不断发展和完善，荧光定量PCR将在更多领域发挥重要作用，为科学研究和临床实践提供强有力的支持。
IlluminaEco荧光定量PCR讲课文档
Plate Layout
第16页，共38页。
Standard Curve
第17页，共38页。
Relative Quantification
用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列 表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者 是在一个过程研究中处于零时的样本。
DEL
TT
AA
Genotyping 5 distinct clusters observed
第29页，共38页。
产品优势
开放的平台：支持实时PCR的全部应用，包括最具挑战性的高分辨熔解（HRM
）曲线分析
性能卓越：灵敏的精密控制的光学技术；精准的温度控制技术和极佳的温度 均一性；Cq值重复性高，数据准确性高，
仪器20分钟左右开启，预热。 配制PCR体系时，加样一定要准确 加每个样品一定要更换枪头，防止交叉污染 样品板上的膜一定要封好 样品上机之前一定要离心，避免气泡影响实验结果
第26页，共38页。
问题……?
谢谢！
第27页，共38页。
厂家简介
Illumina公司是一家集开发，制造及销售用于分析遗传变异 和生物功能的综合系统的高科技公司。1998年成立，2005 年进入中国，并以惊人的速度不断发展，于2007和2009年 两次入选福布斯杂志评出的美国年度成长速度最快的高科技 公司，同时亚太地区也是Illumina全球增长最快的区域。
，通过饱和的插入染料监控DNA熔解曲线变化而进行分析的一种技术。
扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突变， 就会改变DNA链的解链温度。HRM可以区分单碱基差异。
HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，无需使用序列特异性探针，具有高灵 敏度、操作简单、高通量、成本低等优点
二代测序技术-illumina测序原理 -回复
二代测序技术-illumina测序原理-回复二代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是一种高通量、高效率的DNA测序技术，它革命性地改变了基因组学的研究方式。
其中，illumina测序技术是目前应用最为广泛的二代测序技术之一。
本文将以"illumina测序原理"为主题，详细介绍illumina测序技术的原理和相关步骤。
首先，介绍一下illumina测序技术的基本原理。
Illumina测序技术主要是依托于DNA链延伸和合成特性，利用偶联反应（ligation）和桥式PCR （bridge PCR）进行高效的DNA扩增，并通过荧光信号的记录来反应DNA碱基的顺序。
具体而言，illumina测序原理基于以下几个步骤：1. DNA片段准备：首先，需要将待测DNA样本进行处理。
通常，DNA 样本会被打断成短片段，这些片段的长度可以根据具体实验的需求进行调整。
2. 适配体的连接：接下来，需要将适配体连接到DNA片段的两端。
适配体是一段带有特定序列的DNA，它的作用是为PCR反应和测序提供起始位点。
3. 桥式PCR扩增：连接完适配体后，DNA片段被固定在一个玻璃芯片上。
在芯片上，每个片段的两端都会连成一条桥状结构。
接下来，进行PCR 扩增反应。
PCR反应中使用的引物能够帮助完成DNA合成，从而使得DNA片段在桥状结构上进行扩增。
4. 单碱基的加入：桥式PCR反应产生的DNA片段将被转录成RNA，然后再通过逆转录成DNA。
这一过程中，每个DNA链上的荧光核苷酸被加入到模板链上，形成一个新的DNA链。
每种不同的荧光标记代表一个特定的DNA碱基。
5. 荧光信号的检测：在illumina测序仪中，会通过激光的照射和荧光信号的检测来记录每个位置上的DNA碱基。
由于每个位置上只加入一种荧光标记的碱基，可以通过特定的滤光片来分辨不同的荧光信号。
6. 数据分析：最后，通过计算机算法对测序得到的数据进行分析和处理，得到DNA序列的信息。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
荧光定量PCR的原理及应用
荧光定量PCR的原理及应用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）是一种基于荧光信号的分子生物学技术，用于定量检测目标DNA序列的数量。
它结合了传统的聚合酶链反应（PCR）技术和荧光探针技术，通过检测盘细胞PCR扩增过程中产生的荧光信号的数量来确定目标序列的初始模板DNA的量。
以下是荧光定量PCR的原理和应用相关内容。
1.原理：荧光定量PCR基于PCR扩增技术，通过DNA的双链不断不断的分离和扩增，形成指数级别的增加，从而使DNA数量可检测，实现定量的目标DNA检测。
在PCR反应体系中加入DNA荧光探针，该探针含有一个荧光染料和一个阻断器。
在PCR反应中，荧光探针与引物结合，并通过荧光染料发射荧光信号。
当引物与靶DNA序列结合时，即在扩增成产物的过程中，荧光探针被水解，导致发射的荧光不再受到阻断器的遮挡，荧光信号显著增加。
通过检测PCR反应中荧光信号的强度，来确定目标序列的初始模板DNA量。
2.应用：（1）基因表达分析：荧光定量PCR可用于分析特定基因在不同组织、细胞类型或疾病状态下的表达水平差异。
通过测量目标基因的荧光信号，可以定量表达水平。
（2）病原体检测：荧光定量PCR可用于检测并定量常见病原体的存在。
例如，通过检测病毒或细菌的DNA或RNA来确定其感染程度。
（3）遗传疾病诊断：荧光定量PCR可用于检测一些遗传疾病相关基因突变的存在，并定量突变的数量。
（4）细菌或病毒负荷检测：在一些感染疾病的监测中，荧光定量PCR可用于检测和定量病菌或病毒在患者体内的负荷，可用于监测治疗效果。
（5）环境微生物分析：荧光定量PCR可用于分析和定量土壤、水样和空气等环境中的微生物（如细菌、真菌和病毒）的存在和变化。
（6）转基因分析：在转基因研究中，荧光定量PCR可用于检测和定量外源基因的存在并分析其表达水平。
（7）单细胞分析：荧光定量PCR可用于对单个细胞中目标基因或突变的检测和定量。
这对于研究单细胞的异质性和功能以及肿瘤细胞的进化和耐药性等方面的研究具有重要意义。
简述illumina测序原理和流程
简述illumina测序原理和流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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荧光定量pcr的原理和过程
荧光定量pcr的原理和过程荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的改进方法，通过引入荧光探针来实现对PCR反应的实时监测和定量分析。
荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等领域，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优势。
荧光定量PCR的原理基本与传统PCR相同，都是通过不断复制DNA片段来扩增目标序列。
但是，荧光定量PCR在PCR反应体系中加入了特异性的荧光探针，这种探针能够与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号。
通过实时监测荧光信号的强度，可以准确地定量PCR反应中的目标序列数量。
荧光定量PCR的过程主要包括：样品制备、引物设计、反应体系配置、PCR扩增、荧光信号检测和数据分析等步骤。
首先，样品制备是荧光定量PCR的第一步。
样品可以是DNA、RNA或cDNA等，需要根据实验的目的选择合适的样品类型，并进行样品提取和纯化。
接下来，引物设计是荧光定量PCR的关键步骤之一。
引物是用于扩增目标序列的短DNA片段，通常由两个引物组成：前向引物和反向引物。
引物的设计需要根据目标序列的特点，如长度、GC含量、特异性等进行合理选择，并使用生物信息学工具进行引物序列的合成。
然后，反应体系配置是荧光定量PCR的另一个重要步骤。
反应体系通常包括模板DNA、引物、荧光探针、核苷酸三磷酸（dNTPs）、聚合酶和缓冲液等组分。
其中，荧光探针是荧光定量PCR的关键组分，它通常由荧光染料和荧光信号抑制剂构成。
荧光染料可以与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号；而荧光信号抑制剂可以抑制未结合的荧光染料发出的背景信号。
接着，进行PCR扩增。
PCR扩增是通过不断循环进行三个温度阶段的反应来扩增目标序列。
首先是变性阶段，将反应体系中的DNA变性为单链DNA；然后是退火阶段，使前向引物和反向引物与目标序列特异性结合；最后是延伸阶段，聚合酶在适当温度下将dNTPs加入到引物结合的DNA链上，从而合成新的DNA链。
荧光定量PCR实验原理及数据分析
荧光定量PCR实验原理及数据分析1.前处理：首先对待测样本进行DNA提取，并且根据需要可对DNA进行适当的纯化和稀释处理。
2. 反应体系的准备：将PCR反应所需的各种试剂组装到反应管中，包括模板DNA、引物、荧光探针和PCR Master Mix等。
其中荧光探针是含有特定标记荧光分子及其互补序列的寡核苷酸。
3.反应机使用条件的设定：根据所需扩增目标的不同，设置适当的反应条件，包括温度控制、循环次数和步骤等。
4.PCR反应过程监测：在PCR反应的过程中，通过荧光信号的实时监测来定量检测目标DNA。
在扩增过程中，如果靶标DNA存在，则引物与目标DNA结合，荧光探针被引物酶切释放出来，从而增大荧光信号。
5.数据收集与分析：实时采集PCR反应过程中的荧光信号，并通过相应的软件进行数据分析。
常见的荧光曲线分析方法有阈值循环数法（Ct 法）和相对定量法（ΔCt法）等。
在数据分析方面1.Ct值分析：阈值循环数法（Ct法）是一种常用的数据分析方法。
通过设定一个荧光信号的阈值（通常为反应曲线的背景荧光信号的两倍标准差），根据荧光信号的曲线与阈值的交点来计算Ct值。
Ct值越小，说明目标DNA起始含量越多。
2.标准曲线分析：通过引入已知浓度的标准品，制作一条标准曲线。
根据标准曲线，可以推算出待测样本中的靶标DNA的含量。
3.相对定量分析：采用相对定量法（ΔCt法）来比较两个不同样本间的靶标DNA的表达量。
通过比较目标基因与内参基因（如表达稳定的参考基因）的Ct值，计算两者Ct值间的差异（ΔCt），进而得到靶标基因的表达差异。
4.绝对定量分析：通过构建外部标准曲线或使用串联基因的方法，直接定量目标DNA的浓度。
总之，荧光定量PCR技术在医学、生物学和分子生物学等领域的应用非常广泛，对荧光信号的实时监测及数据分析能够提供准确快速的定量结果，为研究者们提供了一个强大的实验工具。
illumina测序的化学原理
illumina测序的化学原理概览illumina是当前最热的二代测序公司，它测序的特点是使用带有可以切除的叠氮基和荧光标记的dNTP进行合成测序，由于dNTP上的叠氮基的存在，每个链每次测序循环只会合成一个碱基，由于A、C、G、T四种碱基所携带的荧光各不相同，因此读取此时的荧光就可以得知此时的碱基类型，重复这个过程，所有碱基序列就可以完成测定了。
illumina测序的工作流程建库->桥式PCR扩增->Read1测序->Read2测序->双端测序（Read3）1. 建库使用超声将DNA样品打碎成小片段，接着T4酶修补末端，klenow酶在3‘末端加A，然后DNA连接酶将测序引物和DNA片段连接，即制成测序文库。
如图所示，即是建好的文库片段。
其中a与e分别与flowcell中的P5与P7互补配对。
b-c是Read1引物结合位点，c'-d是Read2结合位点，用于读取barcode，多样品在同一lane测定时才需要检测，d'-c是Read3结合位点，双端测序时才会用到。
i是index，也叫barcode。
（c与c'互补配对，d与d'互补配对）2. 桥式PCR扩增建好的文库，会加入到flowcell的lane里面进行桥式PCR扩增。
> flowcell是什么>> illumina测序仪中实际进行的测序反应位于flowcell（流动池）中，如图就是一个典型的illumina flowcell，一个flowcell有8条lane（通道），每个lane内表面共价结合了大量的P5、P7短序列（你可以将其想象为一个牙刷，一个平面上有大量的“短发”状序列），P5与P7将会用于结合构建好的文库片段。
* 模板结合，并合成第一链将文库加入到一个lane中去，由于文库两端的序列是和lane内的P5和P7互补的，因此文库片段会和lane 内表面互补结合，如果此时加入dNTP和酶，调至延伸温度，那么就会开始进行第一链合成。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学的实验技术，可以对DNA或RNA目标序列进行定量分析。
本文将介绍荧光定量PCR的原理和结果分析，包括实验步骤、PCR曲线的解读以及测定目标序列的相对表达水平等。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR技术主要基于PCR的原理，即通过模板DNA的逐渐扩增，来定量分析起始模板DNA或RNA的数量。
在实验中，荧光定量PCR通常使用DNA合成酶来合成目标序列的拷贝，通过在每个扩增周期后测量荧光信号的变化，来定量反应的进程。
1.准备试剂和反应体系：包括引物、合成的目标序列等。
2.PCR反应：在热循环PCR仪中，通过一系列不同温度的循环，使模板DNA的扩增合成逐渐发生。
3.荧光信号检测：通过在每个循环后侦测荧光信号的变化，来定量PCR反应的进程和模板DNA的数量。
4.数据分析：通过荧光信号的变化来计算模板DNA或RNA的相对表达水平。
二、荧光定量PCR结果分析1.PCR曲线的解读在荧光定量PCR反应中，通常会绘制荧光信号与PCR循环数的关系图即PCR曲线。
根据PCR曲线的形状，可以得到以下几个关键结果：(1)阈值循环数（Ct）：阈值循环数是PCR曲线上荧光信号超过背景信号的循环数。
Ct值越小，目标序列的初始模板数量越多。
(2) 扩增效率（Efficiency）：扩增效率可以通过计算PCR曲线斜率的反向值得到，通常表达为百分比。
扩增效率越高，说明PCR反应的有效性越好。
(3)Ct值偏移：Ct值偏移是指实验组与对照组（如阴性对照或基准组）之间的Ct值差异。
Ct值偏移的大小可以用于计算相对表达水平。
2.相对表达水平的测定相对表达水平是指在不同实验条件下，目标序列在不同组织或细胞中的表达量相对比较和定量分析。
常用的计算方法有：(1)∆∆Ct法：通过计算实验组与对照组的相对Ct值差异来获得相对表达水平。
∆∆Ct值越大，目标序列的表达水平差异越明显。
荧光定量和数字pcr-概述说明以及解释
荧光定量和数字pcr-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）和数字PCR（Digital Polymerase Chain Reaction）是现代分子生物学研究中广泛应用的两种重要技术。
它们在检测和定量分析目标DNA或RNA的过程中具有很高的灵敏度和准确性。
荧光定量PCR技术基于传统PCR的原理，通过引入一个与特定目标序列相匹配的荧光探针，实现了对PCR扩增产物进行实时监测和定量分析。
该技术不仅可以快速准确地检测目标基因的存在与否，还可以测量目标基因在样本中的相对表达水平。
荧光定量PCR 被广泛应用于疾病诊断、基因表达分析、病原微生物检测等领域。
数字PCR是一种相对较新的PCR技术，它通过将PCR反应液样品分割为大量微型反应容器，每个容器中只有一个目标DNA分子或没有DNA 分子，然后在每个反应容器中进行PCR反应，最终通过统计正反应容器的数目来计算目标DNA的起始拷贝数。
相比于传统的荧光定量PCR，数字PCR具有更高的灵敏度和准确性，并且可以排除样本中的任何潜在干扰物质。
本文将重点介绍荧光定量PCR和数字PCR的原理和应用。
首先将介绍荧光定量PCR的基本原理，包括扩增反应、荧光信号生成以及实时监测和定量分析的原理。
随后会详细探讨荧光定量PCR在疾病诊断、基因表达分析和病原微生物检测等领域的应用，并举例说明其在科学研究和临床实践中的重要性。
接着，我们将转向数字PCR技术。
我们将解释数字PCR与传统PCR 的不同之处，并详细介绍数字PCR的原理和操作步骤。
同时，我们还将详细讨论数字PCR在DNA拷贝数变异检测、稀有基因突变筛查和细胞无创诊断等方面的应用，并展示其在生命科学研究中的潜在价值。
最后，我们将总结荧光定量PCR和数字PCR的优势，并展望未来发展方向。
这两种PCR技术在遗传学和临床医学研究中具有广阔的应用前景，随着技术的不断进步和创新，我们有理由相信荧光定量PCR和数字PCR 将会为我们揭示更多的生命奥秘，为疾病的早期诊断、治疗和预防提供更可靠的科学依据。
荧光定量pcr原理
荧光定量pcr原理荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是一种可以在实验室中快速准确测量DNA的技术，它使用荧光来检测和计算特定DNA序列的定量，在生物学和医学研究中极其重要。
本文旨在深入讨论荧光定量PCR的原理，以及它是如何在分子生物学研究中发挥作用。
一、荧光定量PCR原理荧光定量PCR（qPCR）是一种检测DNA的技术，它使用荧光探针和背景抑制剂来检测DNA片段的存在。
qPCR使用DNA复制的反应来放大特定的DNA序列，并使用荧光探针来检测这些序列。
荧光定量PCR的过程包括三个主要阶段：反应制备、反应启动和反应完成。
在反应制备阶段，实验室工作人员将模板DNA、反转录酶（RT）、DNA聚合酶（Taq）、荧光探针和背景抑制剂放入PCR反应管中。
在反应启动阶段，Taq DNA聚合酶将反应温度升至95摄氏度以上，以启动DNA复制。
在复制过程中，荧光探针捕获复制产物，并发出荧光信号，使其可以被检测到。
在反应完成阶段，实验室工作人员将反应温度降至60摄氏度以上，以终止DNA复制。
在这个阶段，实验室工作人员可以使用特定设备（如实时PCR仪或qPCR仪）测量DNA复制产物的定量，以确定模板DNA的定量。
二、荧光定量PCR的应用荧光定量PCR在分子生物学研究中发挥着重要作用，它可以用来精确测量模板DNA的定量，以及从细胞或组织样本中快速鉴定出特定的基因。
它还可以用来研究不同细胞和组织中特定基因的表达水平，以及研究基因突变、转录因子的活性等问题。
荧光定量PCR在病毒感染的检测中也发挥着重要作用，它可以快速确定病毒的存在，以及病毒在体内的活跃度。
例如，可以使用qPCR快速检测COVID-19病毒，从而帮助诊断和控制疾病的传播。
此外，荧光定量PCR还可以用于在肿瘤组织中鉴定具有致癌潜能的基因突变，并帮助确定患者是否需要接受放疗或化疗治疗。
qPCR技术也可以用于检测细菌和真菌感染，以及检测抗药性菌株，帮助确定最佳治疗方案。
illumina sequencing原理 -回复
illumina sequencing原理-回复Illumina测序技术（Illumina sequencing）是现代生物学研究中广泛使用的高通量测序技术。
它通过使用合成DNA片段、DNA聚合酶和荧光标记的碱基来实现。
本文将详细解释Illumina测序技术的原理，并一步一步回答有关该技术的问题。
首先，我们需要了解Illumina测序技术所依赖的关键概念和方法。
Illumina测序使用逆转录过程来生成合成的单链DNA片段。
这些合成的DNA片段随后会通过PCR（聚合酶链式反应）进行扩增，生成大量的DNA片段。
总的来说，Illumina测序可以分为以下几个主要步骤：文库制备、桥PCR、测序和序列分析。
下面将详细介绍每个步骤。
一、文库制备文库制备是Illumina测序的第一步。
在文库制备过程中，DNA会通过逆转录过程转换为单链的cDNA。
这个过程需要将目标DNA的mRNA模板首先转录成cDNA，然后通过DNA聚合酶合成DNA双链。
生成的DNA双链随后会通过加上适配体的方式引入到测序芯片的上部。
二、桥PCR桥PCR（bridge amplification）是Illumina测序的关键步骤。
在这个步骤中，文库中的DNA片段会通过PCR被扩增为数以百万计的DNA 聚簇（DNA cluster），每个聚簇含有数百个拷贝的DNA分子。
具体说来，桥PCR使用了一种特殊的DNA扩增方式。
首先，DNA片段被固定在测序芯片表面上，并和一个引物相结合。
接着，DNA会先通过局部扩增，形成一个小桥状结构。
然后，这个桥会继续扩增，增长到足够大的尺寸。
最终，我们会得到包含成千上万个DNA聚簇的芯片。
三、测序测序是Illumina测序的核心步骤。
在这个步骤中，我们使用特殊的DNA 聚合酶和有着不同颜色的荧光标记的碱基来进行。
荧光标记的碱基会被加入到在桥PCR过程中形成的DNA聚簇中。
具体来说，DNA聚合酶首先会加入一种荧光标记的碱基到DNA中。
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Plate Layout
RQ vs sample
HRM
高分辨率熔解（High Resolution Melting，HRM）分析技术是基于核 酸的物理性质，通过饱和的插入染料监控DNA熔解曲线变化而进行分 析的一种技术。 扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突 变，就会改变DNA链的解链温度。HRM可以区分单碱基差异。
实验注意事项
仪器20分钟左右开启，预热。
配制PCR体系时，加样一定要准确 加每个样品一定要更换枪头，防止交叉污染
样品板上的膜一定要封好
样品上机之前一定要离心，避免气泡影响实验结果
问题……?
谢谢！
厂家简介
Illumina公司是一家集开发，制造及销售用于分析遗传变 异和生物功能的综合系统的高科技公司。1998年成立， 2005年进入中国，并以惊人的速度不断发展，于2007和 2009年两次入选福布斯杂志评出的美国年度成长速度最快 的高科技公司，同时亚太地区也是Illumina全球增长最快 的区域。 2010年Illumina并购Helixes公司。
该设计从根本上消除了热不均一性和边缘效应 精准的温度控制和卓越的温度均一性提高了数据质量和实验重复性
创新技术
光学系统--光路
CCD Array
Two sets of 48 high-power fixed LEDs for excitation
Series of four band pass filters (upgradeable to 5)
操作软件
Quantitation High Resolution Melting
GG CC
DEL TT AA
14 series of 2 fold serial dilution B-Actin Fam labeled Taqman probe chemistry
Genotyping 5 distinct clusters observed
Absolute Quantification
用于分析某未知样本中个某一核酸分子的绝对量值， 即通常所说的拷贝数。
应用：
病原微生物或病毒含量的检测 转基因动植物转基因拷贝数的检测 RNAi基因失活率的检测
Plate Layout
Standard Curve
Relative Quantification
HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，无需使用序列特异性探 针，具有高灵敏度、操作简单、高通量、成本低等优点 HRM应用主要基于两种技术的进步：
பைடு நூலகம்
具有精确控温装置和高密度数据采集的仪器（解链温度差异极小，零点几摄氏度， 使用高分辨率的仪器才可以检测） 双链DNA嵌入型饱和荧光染料如LC Green
用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中 同一序列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经 处理的对照或者是在一个过程研究中处于零时的样本。 应用： 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如 药物处理、物理处理、化学处理等 ) 特定基因在不同时间的表达差异 cDNA芯片或差显结果的确证
产品简介
Eco 结构
仪器状态指示灯 固定的光学系统 安全的热盖 高性能反应模块 安全门锁 安静的通风系统
32 cm
34.5 cm 32 cm
体积：32×34.5×32 cm；重量：约16 Kg
创新技术
马达 搅拌浆
精准的控温系统 导热元件是一个中空银槽，中空 银槽是密闭的，内含一种特殊液 体导热介质。在PCR循环过程中， 液体导热介质通过两个反方向搅 拌装置驱动，在中空银槽中快速 流动，使热量从半导体均匀传递 到整个银槽。
BeadXpress
Accuracy, versatility and flexibility for molecular testing
Eco
Gold-standard qPCR made accessible
内
容
产品简介 创新技术 操作界面 应用
产品简介
Eco实时荧光定量PCR系统由1975年诺贝尔生理学和医学奖获得者 David Baltimore博士和世界著名光子与微细加工专家Axel Scherer 博士共同研发
Any Sequencing project within reach
Genome Analyzer IIx
Most widely adopted NGS platform
HiScanSQ
Unique combination of sequencing and arrays
HiScan
Speed, quality and versatility for arrays
HRM
原始曲线 随着DNA熔解，Sybr Green被释放，荧光 信号骤降
分 析 过 程
HRM
导出图 “速率”曲线的最高 峰是分离速率最大的 点，即等于熔解温度
HRM
应用： 突变发现/筛查/扫描 SNP 基因分型/等位基因区分 物种鉴定 表观遗传学/DNA甲基化 微卫星分析
Genotyping
Eco™ Real-Time PCR System
基因有限公司
张振华
厂家简介
Illumina的产品服务
新一代测序技术平台 基因芯片技术平台
Sequencing
实时PCR技术平台
qPCR
Arrays
HiSeq2000
Redefining the trajectory of sequencing
HiSeq1000
产品优势
开放的平台：支持实时PCR的全部应用，包括最具挑战性的高分辨熔 解（HRM）曲线分析 性能卓越：灵敏的精密控制的光学技术；精准的温度控制技术和极佳 的温度均一性；Cq值重复性高，数据准确性高， 4色荧光检测：同类产品荧光通道最多 标准化：出厂时已对SYBR、FAM、HEX、VIC、ROX和 Cy5等荧光染料进 行校正，遵循MIQE指导原则 软件：以图标驱动的软件界面，实验设计和设置简单，简洁明了的操 作流程只需3个步骤 通量：48孔反应板，满足绝大多数用户的需求 微量：5~20μl 反应体系，节约成本 快速：40个循环＜40分钟 小型：结构紧凑、体型小巧，适合个人使用 便宜：同类产品价格最低
48 Blue array
48 Green array
创新技术
光学系统--控制过程
Eco 独特的校准优化数据质量
操作软件
独特的图标驱动用户界面，大大简化了实验设计和设置
操作软件
简捷的样品类型设置
操作软件
直观的循环界面
应用
1. 绝对定量分析 2.相对定量分析--基因表达差异分析 3.HRM分析 4.基因分型