客家黄酒中多酚类物质的研究_白卫东
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利用保留时间定性， 标样中的多酚类物质色 谱图和保留时间见图 5（方法 A），图 6（方法 B）。
第 13 卷 第 8 期
客家黄酒中多酚类物质的研究
263
2.3 分析方法评价 在确定的色谱条件下，对多酚标准溶液按不同
梯度进样分析， 根据平均峰面积与多酚标准溶液 的含量关系进行线性回归。 在各相应的线性范围
DOI:10.16429/j.1009-7848.2013.08.029
第 13 卷 第 8 期 2013 年8月
中国食品学报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
Vol． 13 No． 8 Aug． 2 0 1 3
客家黄酒中多酚类物质的研究
关键词 客家黄酒； 多酚类物质； 检测 文章编号 1009-7848（2013）08-0261-07
多酚类物质是一种重要的功能性物质， 具有 较强的清除自由基、抗衰老功能。 黄酒是以糯米为 原料，经传统发酵酿制的，以其保健功能而著称。 客家黄酒是黄酒的一个分支， 其中含有多酚类物 质。 目前国内外关于多酚类物质的检测方法主要 有 紫 外 分 光 光 度 法 [1～2]、荧 光 检 测 法[3]、毛 细 管 电 泳 电 化 学 方 法[4～5]、高 效 液 相 色 谱 法 较 多 [6～7]， 其 中 单 体 酚类的检测最常用方法是高效液相色谱法， 该方 法准确、灵敏。 在用高效液相色谱法检测单体酚的 过程中， 不同种类的物质在色谱柱上吸附的强弱 是不同的，在流动相的洗脱下，不同种类的物质被 分离，表现为它们的保留时间不同。 也有个别的物 质在同一洗脱条件下与另一种物质的保留时间非 常接近，可能产生错误。 为克服这一缺点，在同一 洗脱条件下进行样品中单体酚的检测。 由于流动 相的极性不同，改变流动相的洗脱梯度，物质的保
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 不同发酵阶段的客家黄酒， 由紫金黄龙实业
发展有限公司提供。 不同品牌酒样编号： 1-浙江 某 公 司 的 黄 酒 ；2-广 东 某 公 司 的 客 家 黄 酒 ；3- 广 东 某公司的客家黄酒； 4-江浙某公司的黄酒；5-广 东某公司的客家黄酒； 6-广东某公司的客家黄酒。
内，相关系数均大于 0.9999，相对标准偏差 0.7%～ 2.5%， 表明线性关系良好， 能满足定量分析的要 求，见表 5。 2.4 回收率的检测结果（见表 6）
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0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 保 留 时 间 /min
白卫东 1，2 韩 珍 1 赵文红 1，2 钱 敏 1 陈 朋 1 （1 仲恺农业工程学院 轻工食品学院 广州 510225 2 华南农业大学食品学院 广州 510642）
摘要 为建立高效液相色谱法检测客家黄酒中绿原酸等 7 种多酚类物质的方法， 测定了陈酿 3 年内不同阶段 客家黄酒中多酚类化合物的动态变化，以及市售不同品牌黄酒中 7 种多酚类化合物的含量，结果显示：陈酿 3 年内，随着发酵时间的延长，部分多酚类物质呈增加趋势，部分多酚类物质呈减少趋势。 不同品牌的客家黄酒和 江浙黄酒中多酚类物质的种类和含量有较大差别。 其原因一是黄酒中的多酚类物质是一个水解性单宁分解成 单体酚类和单体酚类络合沉淀的动态平衡过程，二是不同品种、不同产地的原料差异所致。 采用 Diamonsil C18 色谱柱（300 mm×4.6 mm，5 μm）分离，以乙腈-3%乙酸为流动相，线性梯度洗脱，以保留 时 间 定 性 ，峰 面 积 定 量 。 以 7 种 多 酚 类 物 质 的 峰 面 积 与 标 准 溶 液 中 该 物 质 的 含 量 作 校 准 曲 线 ，相 关 系 数 均 大 于 0.9999，相 对 标 准 偏 差 0.7%～2.5%。
乙腈（色谱纯）、冰醋酸（分析纯）。 1.2 主要仪器
高效液相色谱仪，Agilent 110；移液枪。 1.3 方法 1.3.1 色谱条件 Diamonsil C18 色谱柱（300 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进 样量：10 μL；流动相：乙腈，3%乙酸水溶液。 寻找 流动相的梯度洗脱程序， 选择分离效果较好的梯 度洗脱程序，其中较好的 4 种洗脱程序见方法 1、 方法 2、方法 A、方法 B。
0.99998
2～32
2.1
Area=4.19861751Amt-0.085
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1.4
Area=22.4531797Amt-0.20
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Area=13.4554378Amt-1.722
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Area=30.28553Amt-0.50857
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0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.5 22.5
保 留 时 间 /min
图 3 方法 A 条件下的色谱图
Fig.3 Chromatogram of separation （Method A）
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1.2
表 2 HPLC 梯度洗脱程序（方法 2）
Table 2 Gradient eluted program of HPLC（Method 2）
时 间 /min
A/%
B/%
流 速 /mL·min-1
0
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图 1 方法 1 条件下的色谱图 Fig.1 Chromatogram of separation （Method 1）
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0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.5 22.5 保 留 时 间 /min
图 2 方法 2 条件下的色谱图 Fig.2 Chromatogram of separation （Method 2）
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1～16
0.7
Area=44.5483871Amt-0.7
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1～16
2.5
Area=6.83751152Amt-0.22
0.99993
1～16
2.3
儿茶素 绿原酸 香草酸 咖啡酸 丁香酸 P-香 豆 酸 阿魏酸
表 6 7 种多酚的回收率（n=3）
Table 6 Recoveries of 7 components by HPLC analysis （n=3）
Table 5 Regression equations， relative standard deviations of 7 phenolic compounds（n=3）
标准曲线方程
相 关 系 数 /r
线 性 范 围 /mg·L-1
峰面积的 RSD/%
Area=7.05788018Amt-0.131
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保 留 时 间 /min
图 4 方法 B 条件下的色谱图 Fig.4 Chromatogram of separation （Method B）
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保 留 时 间 /min
593min ，p- 香 豆 酸 ；RT23.963min ， 阿 魏 酸 。
图 6 多酚混合标样色谱（方法 B）
Fig.6 Chromatogram of separation （Method B）
儿茶素 绿原酸 香草酸 咖啡酸 丁香酸 P-香 豆 酸 阿魏酸
表 5 7 种多酚类物质的回归方程、相关系数与相对标准偏差（n=3）
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中国食品学报
2013 年第 8 期
表 1 HPLC 梯度洗脱程序（方法 1） Table 1 Gradient eluted program of HPLC（Method 1）
时 间 /min
A/%
B/%
流 速 /mL·min-1
0
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0.8
注 ：RT9.019min，儿 茶 素 ；RT 10.006min，绿 原 酸 ；RT 11.529min，香 草 酸 ；RT12.147min，咖 啡 酸 ；RT13.271min，丁 香 酸 ； RT 19.440min，p-香豆酸；RT22.780min，阿魏酸。
图 5 多酚混合标样色谱（方法 A） Fig.5 Chromatogram of separation （Method A）
收稿日期： 2012-08-30 基金项目： 国家星火计划项目（2011GA780013）；广东省 科
技计划项目（2011B090400 452） 作者简介： 白卫东，男，1967 年出生，教授
留时间发生改变， 所以两种物质很难在两种不同 的洗脱条件下保留时间完全一致。 如果在另一洗 脱条件下依然能够检测到样品中该单体酚， 则认 为检测结果准确无误。
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保 留 时 间 /min
注 ：RT12.783min， 儿 茶 素 ；RT 13.961min， 绿 原 酸 ；RT 16.407， 香 草 酸 ；RT16.921min， 咖 啡 酸 ；RT17.837min， 丁 香 酸 ；RT 22.
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1.2
表 4 HPLC 梯度洗脱程序（方法 B） Table 4 Gradient eluted program of HPLC （Method B）
时 间 /min
A/%
B/% 流速/mL·min-1
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标准溶液，按上述样品处理方法处理样品，然后进 样分析。
2 结果与分析
2.1 洗脱程序 选择分离效果较好的梯度洗脱程序， 分别为
方法 1，方法 2，方法 A，方法 B。 在这 4 种洗脱条 件 下 ，7 种 多 酚 类 物 质 标 准 品 的 分 离 色 谱 图 分 别 见图 1，图 2，图 3，图 4。 可以看出，基线均比较平 稳， 但在方法 1 和方法 2 的条件下香草酸和咖啡 酸分离效果稍差，有重合现象；在方法 A 和方法 B 的条件下色谱图中分离效果最好， 选择方法 A 检 测样品中的多酚类物质，方法 B 作为验证方法。 2.2 定性
原 含 量 /mg·L-1
加 标 量 /mg·L-1
实 测 值 /mg·L-1
回 收 率 /%
3.68
4
7.40
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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RSD/% 1.50 1.70 1.60 1.54 1.17 1.34 1.28
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1.3.2 标准溶液及样品溶液的配制 准确称取标 准品儿茶素、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、丁 香酸、p-香豆酸各 10.0 mg，分别用乙腈定容至 25 mL，得到各标准品的标准溶液。 分别移取 1.25 mL 阿魏酸、丁香酸、p-香豆酸、香草酸标准溶液和 2.5 mL 儿茶素、咖啡酸、绿原酸标准溶液，用流动相[V （3%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=8∶2]定容至 25 mL，得 多酚标准贮备液。 1.3.3 标准曲线 将多酚标准贮备液按 0.5，1.0， 2.0，4.0 和 8.0 μL 的进样量进样，以各单体酚的平 均面积与标准溶液中物质的含量作校准曲线，计 算相关系数。 1.3.4 样品前处理 取不同发酵阶段的客家黄酒 及不同品牌的黄酒用 0.22 μm 微孔过滤，供 HPLC 检测。 1.3.5 回收率 取成品客家黄酒， 加入适量多酚
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表 3 HPLC 梯度洗脱程序（方法 A） Table 3 Gradient eluted program of HPLC （Method A）
时 间 /min
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客家黄酒中多酚类物质的研究
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2.3 分析方法评价 在确定的色谱条件下，对多酚标准溶液按不同
梯度进样分析， 根据平均峰面积与多酚标准溶液 的含量关系进行线性回归。 在各相应的线性范围
DOI:10.16429/j.1009-7848.2013.08.029
第 13 卷 第 8 期 2013 年8月
中国食品学报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
Vol． 13 No． 8 Aug． 2 0 1 3
客家黄酒中多酚类物质的研究
关键词 客家黄酒； 多酚类物质； 检测 文章编号 1009-7848（2013）08-0261-07
多酚类物质是一种重要的功能性物质， 具有 较强的清除自由基、抗衰老功能。 黄酒是以糯米为 原料，经传统发酵酿制的，以其保健功能而著称。 客家黄酒是黄酒的一个分支， 其中含有多酚类物 质。 目前国内外关于多酚类物质的检测方法主要 有 紫 外 分 光 光 度 法 [1～2]、荧 光 检 测 法[3]、毛 细 管 电 泳 电 化 学 方 法[4～5]、高 效 液 相 色 谱 法 较 多 [6～7]， 其 中 单 体 酚类的检测最常用方法是高效液相色谱法， 该方 法准确、灵敏。 在用高效液相色谱法检测单体酚的 过程中， 不同种类的物质在色谱柱上吸附的强弱 是不同的，在流动相的洗脱下，不同种类的物质被 分离，表现为它们的保留时间不同。 也有个别的物 质在同一洗脱条件下与另一种物质的保留时间非 常接近，可能产生错误。 为克服这一缺点，在同一 洗脱条件下进行样品中单体酚的检测。 由于流动 相的极性不同，改变流动相的洗脱梯度，物质的保
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 不同发酵阶段的客家黄酒， 由紫金黄龙实业
发展有限公司提供。 不同品牌酒样编号： 1-浙江 某 公 司 的 黄 酒 ；2-广 东 某 公 司 的 客 家 黄 酒 ；3- 广 东 某公司的客家黄酒； 4-江浙某公司的黄酒；5-广 东某公司的客家黄酒； 6-广东某公司的客家黄酒。
内，相关系数均大于 0.9999，相对标准偏差 0.7%～ 2.5%， 表明线性关系良好， 能满足定量分析的要 求，见表 5。 2.4 回收率的检测结果（见表 6）
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0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 保 留 时 间 /min
白卫东 1，2 韩 珍 1 赵文红 1，2 钱 敏 1 陈 朋 1 （1 仲恺农业工程学院 轻工食品学院 广州 510225 2 华南农业大学食品学院 广州 510642）
摘要 为建立高效液相色谱法检测客家黄酒中绿原酸等 7 种多酚类物质的方法， 测定了陈酿 3 年内不同阶段 客家黄酒中多酚类化合物的动态变化，以及市售不同品牌黄酒中 7 种多酚类化合物的含量，结果显示：陈酿 3 年内，随着发酵时间的延长，部分多酚类物质呈增加趋势，部分多酚类物质呈减少趋势。 不同品牌的客家黄酒和 江浙黄酒中多酚类物质的种类和含量有较大差别。 其原因一是黄酒中的多酚类物质是一个水解性单宁分解成 单体酚类和单体酚类络合沉淀的动态平衡过程，二是不同品种、不同产地的原料差异所致。 采用 Diamonsil C18 色谱柱（300 mm×4.6 mm，5 μm）分离，以乙腈-3%乙酸为流动相，线性梯度洗脱，以保留 时 间 定 性 ，峰 面 积 定 量 。 以 7 种 多 酚 类 物 质 的 峰 面 积 与 标 准 溶 液 中 该 物 质 的 含 量 作 校 准 曲 线 ，相 关 系 数 均 大 于 0.9999，相 对 标 准 偏 差 0.7%～2.5%。
乙腈（色谱纯）、冰醋酸（分析纯）。 1.2 主要仪器
高效液相色谱仪，Agilent 110；移液枪。 1.3 方法 1.3.1 色谱条件 Diamonsil C18 色谱柱（300 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进 样量：10 μL；流动相：乙腈，3%乙酸水溶液。 寻找 流动相的梯度洗脱程序， 选择分离效果较好的梯 度洗脱程序，其中较好的 4 种洗脱程序见方法 1、 方法 2、方法 A、方法 B。
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Area=4.19861751Amt-0.085
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Area=30.28553Amt-0.50857
响 应 值/mAU
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0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.5 22.5
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图 3 方法 A 条件下的色谱图
Fig.3 Chromatogram of separation （Method A）
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表 2 HPLC 梯度洗脱程序（方法 2）
Table 2 Gradient eluted program of HPLC（Method 2）
时 间 /min
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图 1 方法 1 条件下的色谱图 Fig.1 Chromatogram of separation （Method 1）
响 应 值/mAU
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0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.5 22.5 保 留 时 间 /min
图 2 方法 2 条件下的色谱图 Fig.2 Chromatogram of separation （Method 2）
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Area=44.5483871Amt-0.7
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Area=6.83751152Amt-0.22
0.99993
1～16
2.3
儿茶素 绿原酸 香草酸 咖啡酸 丁香酸 P-香 豆 酸 阿魏酸
表 6 7 种多酚的回收率（n=3）
Table 6 Recoveries of 7 components by HPLC analysis （n=3）
Table 5 Regression equations， relative standard deviations of 7 phenolic compounds（n=3）
标准曲线方程
相 关 系 数 /r
线 性 范 围 /mg·L-1
峰面积的 RSD/%
Area=7.05788018Amt-0.131
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图 4 方法 B 条件下的色谱图 Fig.4 Chromatogram of separation （Method B）
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593min ，p- 香 豆 酸 ；RT23.963min ， 阿 魏 酸 。
图 6 多酚混合标样色谱（方法 B）
Fig.6 Chromatogram of separation （Method B）
儿茶素 绿原酸 香草酸 咖啡酸 丁香酸 P-香 豆 酸 阿魏酸
表 5 7 种多酚类物质的回归方程、相关系数与相对标准偏差（n=3）
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表 1 HPLC 梯度洗脱程序（方法 1） Table 1 Gradient eluted program of HPLC（Method 1）
时 间 /min
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注 ：RT9.019min，儿 茶 素 ；RT 10.006min，绿 原 酸 ；RT 11.529min，香 草 酸 ；RT12.147min，咖 啡 酸 ；RT13.271min，丁 香 酸 ； RT 19.440min，p-香豆酸；RT22.780min，阿魏酸。
图 5 多酚混合标样色谱（方法 A） Fig.5 Chromatogram of separation （Method A）
收稿日期： 2012-08-30 基金项目： 国家星火计划项目（2011GA780013）；广东省 科
技计划项目（2011B090400 452） 作者简介： 白卫东，男，1967 年出生，教授
留时间发生改变， 所以两种物质很难在两种不同 的洗脱条件下保留时间完全一致。 如果在另一洗 脱条件下依然能够检测到样品中该单体酚， 则认 为检测结果准确无误。
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响 应 值/mAU
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保 留 时 间 /min
注 ：RT12.783min， 儿 茶 素 ；RT 13.961min， 绿 原 酸 ；RT 16.407， 香 草 酸 ；RT16.921min， 咖 啡 酸 ；RT17.837min， 丁 香 酸 ；RT 22.
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表 4 HPLC 梯度洗脱程序（方法 B） Table 4 Gradient eluted program of HPLC （Method B）
时 间 /min
A/%
B/% 流速/mL·min-1
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标准溶液，按上述样品处理方法处理样品，然后进 样分析。
2 结果与分析
2.1 洗脱程序 选择分离效果较好的梯度洗脱程序， 分别为
方法 1，方法 2，方法 A，方法 B。 在这 4 种洗脱条 件 下 ，7 种 多 酚 类 物 质 标 准 品 的 分 离 色 谱 图 分 别 见图 1，图 2，图 3，图 4。 可以看出，基线均比较平 稳， 但在方法 1 和方法 2 的条件下香草酸和咖啡 酸分离效果稍差，有重合现象；在方法 A 和方法 B 的条件下色谱图中分离效果最好， 选择方法 A 检 测样品中的多酚类物质，方法 B 作为验证方法。 2.2 定性
原 含 量 /mg·L-1
加 标 量 /mg·L-1
实 测 值 /mg·L-1
回 收 率 /%
3.68
4
7.40
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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98.42
RSD/% 1.50 1.70 1.60 1.54 1.17 1.34 1.28
84
16
0.8
15
84
16
0.6
17
80
20
0.6
20
80
20
0.8
1.3.2 标准溶液及样品溶液的配制 准确称取标 准品儿茶素、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、丁 香酸、p-香豆酸各 10.0 mg，分别用乙腈定容至 25 mL，得到各标准品的标准溶液。 分别移取 1.25 mL 阿魏酸、丁香酸、p-香豆酸、香草酸标准溶液和 2.5 mL 儿茶素、咖啡酸、绿原酸标准溶液，用流动相[V （3%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=8∶2]定容至 25 mL，得 多酚标准贮备液。 1.3.3 标准曲线 将多酚标准贮备液按 0.5，1.0， 2.0，4.0 和 8.0 μL 的进样量进样，以各单体酚的平 均面积与标准溶液中物质的含量作校准曲线，计 算相关系数。 1.3.4 样品前处理 取不同发酵阶段的客家黄酒 及不同品牌的黄酒用 0.22 μm 微孔过滤，供 HPLC 检测。 1.3.5 回收率 取成品客家黄酒， 加入适量多酚
1
18
82
18
1
20
80
20
1
25
80
20
1.2
表 3 HPLC 梯度洗脱程序（方法 A） Table 3 Gradient eluted program of HPLC （Method A）
时 间 /min
A/%
B/%
流 速 /mL·min-1
0
96
4
2
5
90
10
1.5
10
85
15
1.0
15
85
15