基于线粒体CO+Ⅱ和Cytb基因序列的8种漠甲系统发育关系

一样品的扩增体积为５０血，反应体系为：１０ Ｘ ｂｕ跪ｒ ５．０汕，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｍｇｃｌ２ ４．０止，０．２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ １．２５皿，１０ ｐｍｏｌ／弘Ｌ的１对引物 各１．５汕，约５０ ｎｇ，弘Ｌ的模板ＤＮＡ ２．０止， ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．５ Ｕ，加去离子水至５０血。扩 增条件为：９４。Ｃ预变性４ ｍｉｎ后，按下列参数进 行３５个循环：９４℃变性４５ Ｓ，５０℃退火ｌ ｍｉｎ，
换主要发生在Ａ＋＋Ｔ之间，咧’１＇ｖ的平均值为
万方数据
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１
２
３
４
５
６７
Ｍ
ｂｐ
一２ ０００
—ｌ ０００
－７５０ —５００ －２５０
一ｌｏｏ
图１部分种类ＰＥＲ结果检测结果
Ｉ，Ｐ，ｍｏｎｇｏｌｉｃａ ２．Ｍ．８ｒａｎｄｌｓ ３．Ａ．ｐｏｔａｎｉｎｉ ４．Ａ， ｇｒａｖｉｄｕｌａ ５．Ｍ．ｋｒａａ场６．Ｐ．础ｔａｔａ ７．Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｐｉｍｅｌｉａ
Ｍ．ＤＮＡ ｍｉｌｋｅｒ
２．１ Ｃｙｔｂ基因序列组成及变异 分析表明，８种昆虫Ｃｙｔｂ基因序列（长５７９
ｂｐ）中共有２３９个核甘酸变异位点，１６２个简约 信息位点，变异率为４１．３％。碱基Ｔ，Ｃ，Ａ，Ｇ的 平均含量分别为３４．４％．２２。５％。３２．４％和 １０．７％，Ａ＋Ｔ平均含量（６６．８％）明显高于Ｇ＋ Ｃ含量（３３．２％）。第三位点表现出非常强的 ＡＴ含量偏向性，Ａ＋Ｔ含量较之前２个位点 高，达到７４．１％，而该位点碱基Ｇ的含量最低， 平均仅为３．２％。８种昆虫的５７９ ｂｐ序列共编 码１９３个氨基酸，其中３４个发生取代，变异率 为１７．６％。在氨基酸组成中，除鳖甲族的宽腹 东鳖甲Ａ．ｇｒａｖｉｄｕｌａ、波氏东鳖甲Ａ．ｐｏｔａｎｉｎｉ和 克氏小鳖甲Ｍ．ｋｒａａｔｚｉ ３种昆虫外，其余５种均 不含半胱氨酸（Ｃｙｓ），由１９种氨基酸组成，其中 亮氨酸（Ｌｅｕ）含量远高于其它氨基酸。从碱基 替换的结果看，序列间转换（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，＇ＩＳ）略多 于颠换（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ，ＴＶ），＂ＩＳ／Ｔｖ的平均值为 １．３。转换的发生主要以Ｃ—Ｔ为主，颠换的发 生主要以Ａ—Ｔ为主，其它类型的替换很少发 生。碱基替换主要发生在密码子第三位点，占 总替换数的７４．６％，第二位点最保守，很少发 生替换，替换率仅为５．２％。 ２．２ ＣＯⅡ基因序列组成及变异
本实验测得８种漠甲ＣＯⅡ基因序列长度 为５８５ ｂｐ的片段，其中变异位点２１０个，变异率 为３５。９％。简约信息位点１４９个。碱基Ｔ，Ｃ， Ａ，Ｇ的平均含量分别为３３．１％，加．０％，３４．６％ 和１２．４％，Ａ＋Ｔ平均含量为６７．７％，第三位点 高达８０．１％，该位点碱基Ｇ的含量在种间差异 很大，在１．０％一８．２％之间，平均为４．１％。共 编码１９５个氨基酸，其中３３个发生取代，变异 率为１６．９％。密码子以Ａ、Ｔ结尾频率高，第三 位是Ｇ的密码子使用较少。在氨基酸组成中， 所有种类均不含半胱氨酸（Ｃｙｓ），由１９种氨基 酸组成，其中亮氨酸（ｋｕ）、异亮氨酸（１ｌｅ）含量 最高，反映出ＣＯ １Ｉ基因在氨基酸组成上具有 一定偏向性。从碱基替换的结果看，序列问转 换略多于颠换，转换主要发生在Ｃ＋＋Ｔ之间，颠
ｒＤＮＡ部分序列进行了分析＂Ｊ，而应用Ｃｙｔｂ和 ＣＯｌｌ基因序列进行的相关研究还未见报道。
本研究以线粒体Ｃｙｔｂ和Ｃ０１１基因作为分 子标记，对漠甲亚科８种昆虫进行特异性扩增

和测序，对它们的序列组成特点进行分析，并以 其序列数据为依据构建分子系统树，对各分类 单元之间的系统关系进行了探讨，为深入研究 该类昆虫的分子进化提供分子水平的证据和资 料。
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７２。Ｃ延伸ｌ ｒａｉｎ，最后１个循环后，７２。Ｃ再延伸５ ＩＩｌｉｎ。扩增产物用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测 大小和亮度，检测结果见图ｌ。对扩增效果良 好的样品委托上海生工生物工程有限公司进行 纯化和双向测序，测序仪为ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７型。
万方数据
的差异研究生物之间的进化关系，为分类学和 系统发育研究提供了新的手段，可以从分子水 平上阐明系统学和进化问题幢１。
当前，线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ， ｍｔＤＮＡ）由于母性遗传方式、易于分离和纯化、 进化速率较核ＤＮＡ快等特点，已成为研究昆虫 系统发育、种群遗传变异和分化、近缘种和种下 分类单元鉴定等最为广泛的遗传标记之一［，’４】。
－宁夏大学自然科学基金资助项目（Ｎ￥０５０３）。 ＊＊Ｅ－ｍａｉｌ：ｄ叫∞５＠１６３．ｃｏｒｎ 重登收稿日期：２００７－０９．１ｌ，侈回日期：２００７．１１－０５，２００８－０１－０２再 修回
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其中蛋白质编码基因细胞色素ｂ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ。Ｃｙｔｂ）基因进化速度适中，适合种间甚至科 间的系统发育分析ｂ１。细胞色素氧化酶亚基ＩＩ 基因（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｏｘｉｄａｓｅⅡｇｅｎｅ，ＣＯ １１基因）在 ｍｔＤＮＡ中的位置比较保守，有较多的进化信息 位点，常被用来分析亲缘关系较近的种、种下分 类单元以及地理种群之间的系统关系№Ｊ。目前 国外从分子水平上对拟步甲昆虫进行的研究还 较少，国内仅刘晓丽等对９种拟步甲的１６Ｓ
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基于线粒体ＣＯⅡ和Ｃｙｔ ｂ基因序列的８种漠甲 系统发育关系＊
代金霞” 张大治
（宁夏大学生命科学学院银川７５００２１）
Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｉｇｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｐｉｍｅｌｉｉｎａｅ ｂａｓｅｄ ｏａ ＣＯ ＩＩ ａｎｄ Ｃｙｔ６薛眦ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＤＡＩ Ｊｉｎ－Ｘｉａ＂’，
２ 结果
本研究测定了漠甲亚科８种昆虫Ｃｙｔｂ基 因长度为５７９ ｂｐ和Ｃ０１１基因长度为５８５ ｂｐ的 部分序列，将所测序列经ＢＬＡＳＴ搜索ＧｅｎＢａｎｋ 表明与现有昆虫的Ｃｙｔｂ和ＣＯ ＩＩ基因序列有很 高的同源性，序列中无碱基的插入和缺失。用 ＭＥＧＡ２．１软件分别统计２个基因的序列组成， 使用无脊椎动物线粒体密码表，对８种昆虫的 密码子使用频率进行统计，推断出各物种Ｃｙｔｂ 和ＣＯ ＩＩ基因编码区的密码子使用频率及氨基 酸组成。
关键词漠甲亚科，Ｃｙｔｂ基因，ＣＯＩＩ基因，系统发育
漠甲亚科Ｐｉｍｅｌｉｉｎａｅ隶属于鞘翅目 Ｃｏｌｅｏｐｅｔｒａ拟步甲科Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ，分布在古北 区、新北区、新热带区和埃塞俄比亚区的荒漠和 半荒漠地区，全球已知约３７族４ ０００种。我国 已知有１０族，西北地区７族。该亚科昆虫经济 意义重大，成虫取食各种沙生植物的残花、落 叶、茎皮和种子，幼虫危害植物嫩芽和根部…。 国内外对漠甲亚科昆虫的研究多集中于形态描 述，不同的分类系统中各类群分类地位差异很 大，这就给研究该类昆虫的系统进化关系带来 了一定的困难。而昆虫的进化关系很难从形态 上来判别，这就需要通过其它辅助方法。现代 分子生物学的发展使我们可以利用生物大分子
１．３ ＤＮＡ序列分析 用ＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓ软件进行正反链的拼接。
将正反链匹配校正后的序列剪除引物部分即所 测得的序列。用ＣｈｓｔａｌＸｌ，８软件对８条序列进 行多重比对，用ＭＥＧＡ２．１软件统计核苷酸组 成，分析各物种间的序列差异。以土甲族的 Ｅｕｍｙｌａｄａ ｐｏｔａｎｉｎｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ检索号：ＥＵ２５０２９５、 ＥＵ２５０３０６）作为外群，基于Ｋｉｍｕｒａ．２参数，采用 邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ，ＮＪ法）、最简约 法（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ，ＭＰ法）构建系统树。
ＺＨＡＮＧ Ｄａ－Ｚｈｉ（啦Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｍｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ８ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｐｉｍｅｌｉｉｎａｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ５７９ ｂｐ Ｃｙｔｂ ａｎｄ ａ ５８５ ｂｐ ＣＯ ＩＩ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ Ｔ，Ｃ，Ａ ａｎｄ Ｇ ｉｎ ｔｈｅ １ １６４ ｂｐ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ３３．７％，２１．２％，３３．５ ａｎｄ １１．６％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ａ＋Ｔ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｃ＋Ｇ．ｗｉｔｈ ７７．２％ｏｆ Ａ＋Ｔ ａｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｃｅｄｏｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｕｔ ｏｎｌｙ ４．Ｏ％ｏｆ Ｇ ａｔ ｔｈｅ ｔⅫｒｌｌｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ／ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｏｓｔｌｙ ｏｃｃｕｒ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃ＋＋Ｔ ｏｒ Ａ Ｈ Ｔ ａｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｗｉｔｈ Ｅｕｍｙｌａｄａ ｐｏｔａｎｉｎｉ∞ｏｕｔｇｒｏｕｐ． ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｓｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅ ｔｒｅｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｐｌａｔｙｏｐｉｎｉ ａｎｄ Ｐｉｍｅｌｉｉｎｉ ｗｅｒｅ ｐｌａｃｅｄ ｉｎ ａ ｃｌａｄｅ．ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｔｈａｔ Ｐｌａｔｙｏｐｉｎｉ ｗ衄ｍｅｒｇｅｄ ｉｎｔｏ Ｐｉｍｅｌｉｉｎｉ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ．Ｔｅｎｔｙｒｉｉｎｉ ｆｏｒｍｅｄ ａｎｏｔｈｅｒ ｍｏｎｏｐｈｙｌｅｔｉｃ ｃｌａｄｅ ｉｎ ｔｈｅ缸优． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｐｉｍｅｌｉｉｎａｅ，Ｃｙｔｂ ｇｅｎｅ，ＣＯ ＩＩ ｇｅｎｅ，ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ