从番茄中提取番茄红素和胡萝卜素

从番茄中提取番茄红素和β－胡萝卜素

1．目的要求

掌握色素提取方法、柱层析分离方法及薄层色谱初步定性方法。了解β－胡萝卜素与番茄红素性质的差别。

2．方法原理

番茄中含有番茄红素和少量的β－胡萝卜素，二者均属于类胡萝卜素。类胡萝卜素为多烯类色素，不溶于水而溶于脂溶性有机溶剂。本实验先用乙醇将番茄中的水脱去，再用二氯甲烷萃取类胡萝卜素。因为二氯甲烷与水不混溶，故只有除去水分后才能有效地从组织中萃取出类胡萝卜素。根据番茄红素与β－胡萝卜素极性的差别，用柱层析可以将它们分离。分离效果可以用薄层层析进行检验。

3．主要实验仪器及材料

新鲜番茄（或番茄酱）。95％乙醇，二氯甲烷，石油醚（60℃～90℃），氯仿，中性或酸性氧化铝（柱层析用），环己烷，硅胶G，饱和氯化钠溶液，无水硫酸钠。

4．掌握要点

层析柱装填与操作方法，薄层点样与展开方法。

5．实验步骤

1）原料处理与色素提取

称取新鲜番茄20g捣碎，于100 mL圆底烧瓶中，加95％乙醇40 mL，摇匀，装上回流冷凝管，在水浴上加热回流5min，趁热过滤，只将溶液倾出，残渣留在瓶内，加入30 mL二氯甲烷，水浴上加热回流5 min，冷却，将上层溶液倾出抽滤，固体仍保留在烧瓶内，再加10 mL二氯甲烷重复萃取一次。合并乙醇和2次二氯甲烷提取液，倒入分液漏斗中，加5 mL饱和氯化钠溶液（有利分层），振摇，静止分层。分出橙黄色有机相，使其流经一个在颈部塞有疏松棉花且在棉花上铺一层1 cm厚的无水硫酸钠的三角漏斗，以除去微量水分。将此溶液贮存于干燥的有塞子的锥形瓶中。层析之前，将此溶液在通风橱中用热水浴蒸发至干。

2）柱层析分离

氧化铝层析柱的装填方法：将层析柱垂直固定于铁架上，铺上一层薄薄的石英砂，关闭活塞。称取15g氧化铝置于50ml锥形瓶中，加入15ml石油醚（顺序不能反）边加边搅，且不断旋摇直至成均匀浆液（稠厚但能流动），向柱内加入溶剂（石油醚）至半满，然后开启活塞让溶剂以每秒一滴的速度流入小锥瓶中，摇动浆液，不断地逐渐倾入正在流出溶剂的柱子中，不断用木棒或带橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身，使顶部成水平面，将收集到的溶剂在柱内反复循环几次，以保证沉降完全和装紧柱。整个过程不能让柱流干。待溶剂刚好放至柱顶刚变干时即可上样。

取一只长15 cm左右内径为1～1.2 cm的层析柱，柱内装有用石油醚调制的氧化铝。将粗制的类胡萝卜素溶解在4 mL苯中，用滴管在氧化铝表面附近沿柱壁缓缓加入柱中（留1～滴供以后的薄层层析用），打开活塞，至有色物料在柱顶刚流干时即关闭活塞。用滴管取几毫升石油醚，沿柱壁洗下色素，并通过放出溶剂至柱顶流干，从而使色素吸附在柱上。然后加大量的石油醚洗脱，黄色的β－胡萝卜素在柱中移动较快，红色的番茄红素移动较慢。收集洗脱液至黄色的β－胡萝卜素从柱上完全除去，然后用极性较大的氯仿作洗脱剂洗脱番茄红素（注意更换接受瓶）。将收集到的两个部分在通风橱内用热水蒸发至干。将样品分别溶于尽可能少的二氯甲烷中，尽快进行薄层层析。

3）薄层层析

在用硅胶G铺成的薄板上距离底边约1 cm处，分别用毛细管点上3个样品，中间点为未分离的混合物，两边分别点上分离得到的β－胡萝卜素和番茄红素。可以多次点样，即点完一次，待溶剂挥发后再在原来的位置点样。但要注意，必须在同一位置上点，而且样品斑点尽量小。点样时毛细管只要轻轻接触板面即可，切不可划破硅胶板。样品之间的距离为1～1.5 cm。将此板放入样装

有环己烷作展开剂的层析缸中，盖上盖子。切勿让展开剂浸没样品斑点。待溶剂展开至10 cm左右时，取出层析板。因斑点会氧化而迅速消失，故要用铅笔立即圈出。计算不同样品的Rf值，比较不同样品Rf值大小的原因以及分离效果。

＝溶质最高浓度中心至原点中心的距离／溶剂前沿至原点中心的距离

R

f

实验思考题

1）在本法中，柱层析和薄层层析的操作要点是什么

2）从其它原料提取的类胡萝卜色素，能应用此方法分类类乎萝卜素物质吗

3）能用此法分离类胡萝卜素之外的哪些物质

4、薄板层析

色谱法是分离和鉴定有机化合物的常用方法。

原理：利用混合物各组分在固定相和流动相的溶解度不同，即在两相间分配系数的不同而使各组分分开。

特点：时间短；分离效果好；需要样品量少；适用于在较高温度下容易发生化学变化的化合物。

事先准备：用铅笔和尺子轻轻画出起始线和终止线；

点样：用直径1mm的平头毛细管点取提取物，先在废纸上点一下（快速），然后在起始线线上少量多次地点样（保证一定浓度，一般需要50次以上）。待溶剂挥发以后，轻放到装好展开剂地展开缸内，不要让展开剂溅起或倾斜；

展开（爬板）：当展开剂爬到终止线时，停止爬行，取出。因为b-胡萝卜素（黄点）易挥发，所以要尽快画出黄点的位置；

Rf值的计算：分离效果好时Rf应为～之间。

意义：定性鉴定，监测化学反应等等。

（点样：在薄板一端10mm（下）及另一端5mm（上）处用铅笔轻轻画一道痕迹，用直径小于1mm的毛细管（平口）点样，点样时要做到少量多次，保证样品点小而又有一定的浓度，一块板上可以点两个点。展开剂的选择：根据样品的极性而定，极性大的化合物可选用极性较大的展开剂。为达到较好的分离效果，可用混合溶剂。做多次展开后可确定一合适的配比。展开时，溶剂前沿离板顶5mm停止。

显示方法：A)有色化合物可直接观察；B)无色的，用显色剂显色，如碘熏法；紫外光显色，用硅胶GF254，有样品点的位置再紫外灯光照射下发暗。）本次实验使用95％乙醇和二氯甲烷提取。两种混合后用NaCl水溶液洗涤。乙醇主要进入水相，建议水相不要弃去。点样时在一块板上点两点：一为有机相，一为水相。观察比较有何不同。

展开剂的配比控制在石油醚:丙酮=9:1。同时可以做一个比较，采用12:1。在混合展开剂中丙酮的极性大于石油醚，因此如果丙酮含量增大，极性增大，使得分离效果很差。如果增加石油醚的含量，使展开剂的极性变小，分离效果较好。

观察：如果红点紧追黄点，且Rf>，则要增加石油醚的用量如达到12:1。

番茄红素为红色，b-胡萝卜素为黄色，展开后的薄板放置一段时间后，样品颜色褪去。因为b-胡萝卜素极易氧化，故在提取和展开过程中，注意不要敞开口，要用瓶盖盖住。

番茄红素的双键比b-胡萝卜素的双键多，因此番茄红素的极性大，在爬板时爬地慢，在下面，b-胡萝卜素的极性小，爬地快，且易氧化。