佐剂及灭活疫苗的制作

硬脂酸铝、去水山梨酸单油酸酯（Span-80）、聚氧乙烯去水山梨酸单油酸酯（Tween-80）和羊毛脂为阴 离子类乳化剂，具有一定的亲水性和亲油性基团。乳化剂的亲水亲油平衡值（HLB 值）与其在水中的 溶解度相关。亲油性的在水中溶解度小，HLB 值低，易形成油包水型油乳剂。亲水性强的在水中溶解 度大，HLB 值高，容易形成水包油型油乳剂。 （二）铝胶的制备方法主要有三种，包括用铝粉加烧碱合成法、用明矾加碳酸钠合成法和用三氯化铝与
4、种毒：兔病毒性出血症灭活疫苗病毒株
5、实验动物：健康青年兔 13 只。
五、实验步骤
（一）兔病毒性出血症病毒增殖和组织灭活疫苗的制备
1、病毒增殖：取生产用毒种，用无菌生理盐水做 l0 倍稀释，选择非免疫的健康青年兔，肌肉注射 ，
接种剂量 0.5ml／只。隔离饲养观察 3-7d。
2、组织悬液的制备：分别无菌采取死亡兔的肝脏、脾脏、肺脏，加 l0 倍的灭菌 PBS 缓冲液，用 组织捣碎机粉碎搅拌，冻融 3 次。
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少量菌液，接种于普通营养琼脂平板，37℃培养 24-48h，进行灭活检验。菌液灭活后应无菌生长。 （三）油乳剂灭活疫苗的配制
1、油相准备：实验一所准备的油相。 2、水相准备：菌液 96 份，Tween-80 4 份，充分振荡，使吐温完全溶解。 3、乳化：加入油相 1 份，开动胶体磨（采用组织捣粹机），慢速转动，徐徐加入水相 1 份 ，7000-10000r ／min 搅拌 5min。 （四）氢氧化铝胶灭活疫苗的配制 1、将实验一所制备好的铝胶弃去上清液后，加入适量的灭活抗原液（一般抗原与铝胶体积比为 4： 1），混匀，即成。（或按实验一佐剂制备方法二制备的铝胶，用量一般为终浓度是 0.5~2.0mg/ml。） （五）蜂胶灭活疫苗的配制 1、在灭活菌液中加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂胶 10mg，边加边摇荡，成为乳浊状，即 为蜂胶佐剂疫苗。
3、纯粹检验：将培养的细菌菌液接种于琼脂培养基表面，36-37℃保温 24h。观察菌落大小，应均
匀一致。
4、细菌计数：用麦氏比浊管法测定菌数，将菌数调整为 15 亿个／ml。（即与麦氏比浊管的第 5 管
相同）
（二）细菌灭活
1、按菌液体积加入终浓度为 0.3％的甲醛溶液，于 37℃温箱中灭活 24h，其间振荡数次。灭活后取
四、实验材料
1、设备：兔笼、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、摇床、高压锅、组织匀浆器、微量加样器、酒精灯、 试管、灭菌纱布、三角瓶、l-5m1 注射器若干、疫苗瓶等。
2、试剂：磷酸盐缓冲液（PBS）（ 0.01mol/L，pH7.4）、甲醛溶液、0.5%鼠红细胞等。 3、实验一所制备的氢氧化铝胶、蜂胶。
六、注意事项
1、灭活要彻底，以免影响疫苗的安全性。 2、水相制备时，使抗原与 Tween-80 充分混匀。 3、乳化时，注意将油相冷却后再乳化，以防油温过高使抗原性降低。 4、注意先加入油相后再加入水相，充分搅拌。
七、实验结果记录
八、实验总结
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蜂胶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎、增强机体免疫功能和促进组织再生等作用，同时具有广泛
的生物活性和药理作用。作为免疫佐剂，蜂胶具有良好的免疫增强作用。它能保持抗原特性，增强巨噬
细胞的吞噬能力，促进抗体的产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。
四、实验材料
1、设备：高压灭菌锅、电炉、搪瓷缸、100-120 目铜纱筛滤网、吸管、玻璃瓶、粉碎机或垫板和锤头、 研磨器、量筒、玻璃捧、离心机等。
管号
试剂
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1%BaCl2 溶液（ml） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
１％H2SO4（ ml） 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.2 9.0
相当于细菌的浓度
单位 108 个／ml
3
6
9
12 15 18 21 24 27 30
二、实验内容
1、配制白油佐剂； 2、配制氢氧化铝胶佐剂； 3、配制蜂胶佐剂。
三、实验原理
油佐剂、氢氧化铝胶和蜂胶常用于兽用灭活疫苗。佐剂活性与质量密切相关，优质佐剂应具备分子
细腻、胶体性良好、稳定和吸附力强等特点。 （一）油佐剂由矿物油和乳化剂组成。矿物油应不含多环芳烃化合物、粘度低、无色、无味和无毒性。
实验三、兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备
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成绩：
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一、实验目的
1、了解并掌握兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备程序。
二、实验内容
1、兔病毒性出血症病毒增殖和组织灭活疫苗的制备。
三、实验原理
兔病毒性出血症病毒可引起兔严重疾病，病毒培养困难，现仍然没有发现适应病毒体外培养的细胞
二、实验内容
1、大肠杆菌培养与细菌的灭活； 2、大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的配制； 3、大肠杆菌氢氧化铝胶灭活疫苗的配制； 4、大肠杆菌蜂胶灭活疫苗的配制。
三、实验原理
细菌性灭活疫苗制备的基本程序为菌种的选择和种子的生产、菌液培养、灭活、配苗和分装。 大量生产的细菌培养方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养 法及连续培养法等。灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行。 灭活疫苗的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。
四、实验材料
1、设备：超净工作台、恒温培养箱、冰箱、摇床、胶体磨（采用组织捣粹机）、压盖机、高压锅、显微 镜、酒精灯、温度计、普通试管、三角瓶、平皿、疫苗瓶、瓶盖、记号笔等。 2、试剂：营养琼脂培养基、普通肉汤培养基、甲醛溶液等。 3、实验一所制备的油乳剂、氢氧化铝胶、蜂胶。 4、菌种：鸡大肠杆菌灭活疫苗菌种。 5、麦氏比浊管制备：选取口径、壁厚一致的洁净试管 10 支按如下操作。
七、实验结果记录
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八、实验总结
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实验二、鸡大肠杆菌灭活疫苗的制备
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一、实验目的
1、了解细菌性灭活疫苗制造的基本原理及程序。
六、注意事项
1、硫酸有很强的腐蚀性，应放在耐酸搪瓷缸配置，操作要十分小心，防止爆沸时溅出，造成伤害。 2、氢氧化铝具有较强的吸附力，所以制胶过程中一般用软化水或去离子水洗涤。 3、氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态，故要掌握好化合时的 pH。 4、油相制备时，温度和时间要掌握好，要使 Span-80 和硬脂酸铝充分溶解。
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动物检疫实验室
２００９年５月
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实验一、佐剂的制备
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一、实验目的
1、掌握白油佐剂的制备方法； 2、掌握用铝粉加烧碱合成法制备氢氧化铝胶的方法； 3、掌握蜂胶佐剂的制备方法。
氢氧化钠合成法。其中，用铝粉加烧碱合成法最为常用，其基本原理为：
2Al(OH)3 十 12H2O 十 3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O。 Al2(SO4)3·18H2O 十 6NaOH→2Al(OH)3 十 2Na2SO4 十 18H2O。 用三氯化铝与氢氧化钠合成，此法合成的铝胶含量低，透明无沉淀，目前广泛用于制备人用生物
1、称取氢氧化铝干粉 50g，加入煮至沸腾的 60ml 沸水中（搪瓷缸）拌均匀。
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2、缓慢倒入硫酸 100m1，爆沸至棕褐色，大约 30min。 3、加温水，边加边搅拌约至总量为 350m1。 4、加温水稀释至 1000ml，温度约为 80℃(A 液)。 5、另一缸盛 80g 烧碱，加水至 1000ml，加温至 75℃(B 液)。 6、将 A 液和 B 液等量缓慢流人另一耐酸搪瓷缸内（控制两液流速），化合液 pH 为 6.9±0.1 时化 合结束。 7、用蒸汽熟化 10min，调节 pH 6.9±0.1，继续熟化 3min，稳定 pH 6.9±0.1，静置沉淀。 8、吸去上清液后加入约 5 倍量的软化水，搅拌洗涤沉淀、弃上清液，此 3-5 次。 9、用 100-120 目铜纱筛滤过，装入布袋脱水过夜，收存于容器内，约得 600g 铝胶。 （二）氢氧化铝胶佐剂的配制之二：三氯化铝与氢氧化钠合成法 1、先将无水三氯化铝用去离子水配成 25％溶液，加热溶化，使用时再稀释成 8％，加温至 56-60 ℃。 2、将氢氧化钠配成 4％溶液，加温至 56-60℃。 3、化学合成时，将三氯化铝溶液放入反应缸，维持温度 60℃，边搅拌边缓慢加入氢氧化钠溶液， 当化合液 pH 值达到 5.6-6.0 时，即为终点，继续搅拌 10min，分装，121℃高压灭菌 30min 后的铝胶液 为透明略带乳光液体，PH 值为 5.5±0.1。 以上方法合成的铝胶性状为可塑型棉绒状胶体，经搅拌逐渐变稀成细腻的胶体。 （三）氢氧化铝胶佐剂的配制之三：明矾加碳酸钠合成法 1、明矾（12 水合硫酸铝钾）500g，加水 200ml 稀释，加热溶解，温度降至 60℃时备用。 2、50%氨水 120ml，加入上述溶液中，边加边搅拌。 3、蒸馏水洗涤至 PH7.0，10%的 BaCl2 检测无沉淀。
系或组织细胞。最适应病毒生长的是乳鼠和青年兔，所以现仍然采用本动物兔来增殖病毒制备疫苗。兔
感染病毒后 18-24h 组织中出现病毒，其中肝组织病毒含量最高，感染后 18h 达高峰，其次为脾、肺、 肾、血液和心脏等，而肌肉、脑、淋巴结、胸腺等组织含毒量均很低。
病毒组织经 0.4％甲醛处理后仍保持免疫原性。
五、实验步骤
（一）大肠杆菌菌液培养
1、种子液：将大肠杆菌菌种，分别于小管或小瓶普通肉汤培养基中，置 36-37℃保温 18-24h，经
纯粹检验后作为种子液。
2、细菌培养（小量培养）：将种子液接于营养琼脂培养基表面，36-37℃保温 24h。加适量灭菌生
理盐水将细菌洗下，装入玻瓶中，充分振荡菌液，使细菌分散开。
配制时应注意：
（1）氢氧化铝具有较强的吸附力，所以，制胶过程中一般用软化水或去离子水洗涤； （2）氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要掌握好化合时的 PH 值； （3）贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，并严密封盖，贮存期不超过 3 个月； （4）铝胶室温保存，以免破坏胶态。 （5）必须根据反应式 A1Cl3+3NaOH→Al(OH)3+3NaCl 计算出氢氧化铝胶的量，以备后期按量使用 。 （四）蜂胶佐剂的配制 1、用市售蜂胶，放于 4℃以下低温存放，制备前用粉碎机或垫板和锤头在 4-8℃下粉碎。 2、过筛（100-120 目铜纱筛滤网），按 1:4（w／v）加入 95％乙醇，室温浸泡 24-48h。 3、冷却，过滤或离心取上清液，即得透明栗色纯净蜂胶浸液。 4、除去干渣，计算出浸液中蜂胶含量，浸液置 4℃以下保存备用。 5、必须计算出蜂胶的量，以备后期按量使用。
2、试剂：7-10 号白油、Span-80、硬脂酸铝、氢氧化铝干粉、三氯化铝、硫酸、去离子水、氢氧化钠、 PH 试纸、95％乙醇等。
五、实验步骤
（一）白油佐剂的配制
1、取 7-10 号白油 470m1，Span-80 30ml，硬脂酸铝 10g，混合后用力振摇，116℃高压灭菌 30-40min， 冷却至 50℃左右，再用力振摇至透明均质状，即为白油佐剂（油相）。 （二）氢氧化铝胶佐剂的配制之一：铝粉加烧碱合成法
制品，佐剂效果良好，注射部位无硬结反应。其化学反应式为：A1Cl3+3NaOH→Al(OH)3+3NaCl。 （三）蜂胶是蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其他植物幼芽分泌的树脂，并混入蜜蜂上顎腺分泌物以及蜂
蜡、花粉及其他一些有机与无机物的一种天然物质，含有多种黄酮类、酸类、醇类、酚类、脂类、烯烃 和萜类等化合物及多种氨基酸、酶、多糖脂肪酸、维生素及化学元素，是一种优良的天然药物。