第四章-基因工程的常规技术上
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基因工程的四大技术
基因工程的四大技术
1.基因克隆技术：基因克隆技术是指将某个有意义的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA分子，再将其导入细胞中，使细胞表达出与该DNA片段相关的功能蛋白质。
这一技术是基因工程的重要基础，也是其他技术的前提。
2. 基因敲除技术：基因敲除技术是利用RNA干扰或CRISPR/Cas9技术，将目标基因的DNA序列进行改变或剪切，使其失去功能。
这一技术可以用于研究基因功能，识别疾病基因，以及开发新的治疗方法。
3. 基因编辑技术：基因编辑技术是利用CRISPR/Cas9等技术，直接对基因进行编辑，使其发生精准的改变，如点突变、删除、插入等。
这一技术可以用于治疗遗传病、改良农作物品种等领域。
4. 基因合成技术：基因合成技术是利用化学合成方法，将DNA 序列按照设计的顺序合成，形成具有特定功能的基因。
这一技术可以用于合成人工基因、改良生物代谢途径等应用。
- 1 -。
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
必修一生物第四章知识点归纳
必修一生物第四章知识点归纳第四章《基因工程与生物技术》主要讲解了基因工程的概念和原理、基因工程在农业、医学和环境保护中的应用等内容。
以下是该章节的主要知识点归纳：1. 基因工程的概念：基因工程是指通过人为手段将不同来源的DNA分子有目的地嫁接、组合或重新组合成新的DNA分子，然后将其转入宿主细胞中，并使其发生遗传转化。
基因工程技术包括基因克隆、基因切割、DNA连接、转基因技术等。
2. 基因工程的原理：基因工程的基本原理是通过DNA分子的切割、连接以及转导到宿主细胞中实现特定基因的表达。
常用的工具包括限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、基因枪等。
3. 基因工程在农业中的应用：基因工程技术已经成功应用于农业领域，例如转基因作物的培育。
通过导入耐旱、抗虫害等特性的基因，可以提高作物的产量和抗性，减少化学农药的使用量。
4. 基因工程在医学中的应用：基因工程技术在医学领域有广泛应用，如生产重组蛋白质药物、基因诊断和基因治疗等。
通过基因工程技术可以生产出大量纯化的蛋白素药物，用于治疗多种疾病。
5. 基因工程在环境保护中的应用：基因工程技术还可以用于环境保护，例如基因工程菌株的应用可以清除环境中的有害物质，减少污染。
6. 转基因食品的争议：转基因食品指的是通过基因工程技术改变而来的食品。
由于转基因食品可能带来的潜在风险，如不良反应或对生态环境产生不良影响，因此在食品安全和生物安全方面引发了一些争议。
7. 生物技术的发展和前景：生物技术是以生物学为基础、利用生物分子、细胞和生物体制作新材料、新产品和新装置的技术。
生物技术的发展前景广阔，可以应用于农业、医学、环境保护、能源等多个领域，为人类的生活和产业带来巨大的改变。
基因工程的基本技术
基因工程的应用领域
医学应用
基因工程在治疗遗传病、癌 症、生殖健康和药物研发等 方面具有巨大潜力。
农业应用
基因工程可改良作物，使其 耐虫、耐旱、耐盐等，提高 农作物产量和抗性。
工业应用
基因工程可制造用于生产药 物、酶、化学品和燃料的工 业微生物。
基因工程的伦理和社会问题
1 伦理问题
2 社会问题
基因工程引发了关于人类改造、基因编辑 道德和隐私权的伦理问题。
结论
基因工程在改变生物基因、创新医学和改进农业方面具有巨大的潜力，但我 们也必须谨慎处理伦理和社会问题。
基因工程可能导致社会不平等、基因歧视 和境界红利等一系列社会问题。
基因工程的发展趋势
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
应用扩大
2
基因工程将在更广泛的领域应用，包
括环境保护、能源开发和生物技术等。
3
精确性增加
随着技术的提高，基因工程的精确性 将不断增加，有望实现更精确的基因 编辑和控制。
伦理规范
随着技术的发展，必须建立严格的伦 理规范来引导基因工程的应用和发展。
基因工程的基本原理
1 基因克隆技术
使用DNA重组技术将特 定基因导入宿主生物， 以制造具有特定功能的 生物体。
2 基因编辑技术
使用现代CRISPR-Cas9等 技术，直接修改生物基 因的序列，以实现精确 的基因改变。
3 基因转移技术
将一个或多个基因从一 个物种转移到另一个物 种，以增加特定功能或 改良生物体。
基因工程的基本技术
基因工程是一项重要的生物技术，利用进化原理，改变或修改生物体的基因 来达到特定目的。它应用广泛，影响深远。
基因工程的定义和背景
定义
基因工程是研究和应用工程原理来改变生物基因的技术，以创造新功能或改进生物体。
基因工程常规技术-聚合酶链式反应
PCR仪器的变迁
三个水浴锅， 用手移动 （Mullis等人当时用的） 电加热块 ＋ 自来水冷却 （PE，1988） 电加热块 ＋ 内置循环液冷却 （PE，1989） 三个加热块 ＋ 机械手 （Stratagene，1994） 半导体制冷和加热 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler) 风加热 Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)
19
④ Taq DNA聚合酶的激活剂
金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。
当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L
时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。 50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。
20
其它耐热 DNA聚合酶
1）Pfu DNA Polymerase
4
2
⑨涉及cDNA研究的引物
跨内含子引物
31
在线免费引物设计网站
/ /tools/primerblast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
软件
Primer5.0、 Oligo6.0
22
引物（primer)——决定PCR反应的特异性
① 位置
与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补 （ 5‘端相同）的短DNA。 3’
3’
23
② 引物的长度
理论计算： 416=4.29109。 即 4.29109bp 的基因组中有一次完全与 16 个 核苷酸的序列相同的机会。 人类基因组=3 109bp 一般引物设计为长16-30bp，多数情况下大于18bp， 如有特殊要求，引物长度可达50~60bp
基因工程的原理和技术ppt
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序列, 又可以怎样操作？
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
第四章基因操作的技术原理(电泳)
1 琼脂糖凝胶电泳的参数：
（1） 缓冲液 （2）凝胶的浓度 （3） 加DNA样品：<1μg，载样缓冲液(溴酚蓝，甘油） （4） 电泳条件 （5）染色和观察
（1） 缓冲液：
常用的几种电泳缓冲液有： TAE[Tris-乙酸和EDTA (pH8.0)] TBE(Tris-硼酸和EDTA) TPE(Tris-磷酸和EDTA) 一般配制成浓缩母液（10X或5X）,储于室温。
（4） 电泳条件
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压 成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的 DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大, 因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压 增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
大片断低电压长时间 小片段高电压短时间
（5） 染色和观察：
PFGE can resolve large DNA fragments
6. 混合DNA样品和0.2倍体积6×指示剂。 7. 用微量移液器将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质 量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。 8. 关上电泳槽盖，接好电极插头。给予合适的电压。 9. 当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电 极插头和打开电泳槽盖. 10. 转移凝胶至凝胶成像系统内观察。
溴化乙锭（ethidium bromide,EB）染色，
溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到 堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使 其刚性更强。
1 常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB）， 染色效果好， 操作方便，但是稳定性差， 具有毒性，致癌作用。 2 SYBR Green ， GelRed 毒性小，但价格贵。 3 GeneGreen 相比则是性价比高的低毒 替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10 倍以上。
基因工程的原理及技术
基因工程的原理及技术导言基因工程是一门重要的生物学分支，通过改变生物体内的基因组成，使其具有特定的性状和功能。
随着基因工程领域的不断发展，人类已经可以利用基因工程技术来改良农作物、研发新药、治疗基因疾病等。
本文将介绍基因工程的基本原理和常用技术。
基本原理基因是生物体内控制遗传信息的载体，基因工程的核心原理是通过改变特定基因的组成及其表达方式来改变生物体的性状和功能。
基因工程的基本原理包括以下几个方面：1.基因克隆：基因克隆是基因工程的重要手段之一。
通过将特定基因从一个生物体中剪切出来，并将其插入另一个生物体的染色体中，实现对目标基因的复制和表达。
常用的基因克隆方法包括限制性内切酶切割和连接、PCR 扩增等。
2.DNA序列分析：DNA序列分析是基因工程研究的基础。
通过对基因组DNA的测序和分析，可以对基因的结构、功能和调控进行深入研究。
DNA 序列分析常用的技术包括Sanger测序、高通量测序、基因芯片等。
3.基因敲除和突变：通过基因敲除和突变技术，可以特异性地删除或改变目标基因，从而观察其对生物体性状和功能的影响。
常用的基因敲除和突变技术包括RNA干扰、CRISPR-Cas9系统等。
4.基因表达和调控：基因的表达和调控是生物体内基因功能发挥的关键环节。
基因工程可以通过改变基因的启动子、增强子等序列，实现对基因表达和调控的精确操控。
常用的基因表达和调控技术包括质粒转染、转基因技术等。
常用技术基因工程领域有多种常用技术，以下列举几个代表性的技术：1.质粒转染技术：质粒转染技术是一种常用的基因工程技术，通过将外源基因表达载体（质粒）导入宿主细胞，实现基因的表达和功能研究。
该技术广泛应用于基因治疗、农作物遗传改良、疫苗研发等领域。
2.转基因技术：转基因技术是将外源基因导入到目标生物体中，实现特定性状的引入或改良。
转基因技术在农作物育种和药物研发中发挥了重要作用，成功开发出了多种转基因作物和转基因药物。
3.CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9系统是一种先进的基因编辑技术，具有高效、精确和可编程的特点。
基因工程第四章目的基因的分离和合成
了解基因合成在基因工程中的应用，并探讨其潜在的发展方向。
基因的分离方法
电泳分离
利用电场的作用，通过基因的大小和电荷差 异来分离目的基因。
过滤膜分离
利用过滤膜的孔隙大小，将目的基因与其他 分子分离。
基因的合成方法
1
Байду номын сангаас
基因合成的步骤
2
包括设计基因序列、合成基因、验证
基因等步骤。
3
基因合成的原理
利用化学合成的方法合成目的基因的 DNA序列。
基因合成的应用
用于基因工程研究、生物医药和农业 领域，推动科学发展。
实验步骤
1. 收集目的基因样本 2. 提取目的基因DNA 3. 分离目的基因 4. 合成目的基因 5. 验证合成的目的基因 6. 分析实验结果
结果与讨论
实验结果表明电泳分离和过滤膜分离是有效的基因分离方法，基因合成技术 可用于合成目的基因。讨论了实验过程中的优缺点和改进方法。
结论和展望
基因工程中的目的基因的分离和合成方法有重要的应用价值，未来可以进一 步优化分离和合成技术，提高实验效率和基因合成的准确性。
基因工程第四章目的基因 的分离和合成
本章介绍了基因工程中的目的基因的分离和合成方法，包括电泳分离和过滤 膜分离，以及基因合成的原理、步骤和应用。
实验目的
1 了解基因工程的目的基因
明确在基因工程中需要分离和合成的目的基因。
2 掌握基因的分离和合成方法
学习电泳分离、过滤膜分离和基因合成的原理和步骤。
3 了解基因合成的应用
基因的分离方法
电泳分离
利用电场的作用，通过基因的大小和电荷差 异来分离目的基因。
过滤膜分离
利用过滤膜的孔隙大小，将目的基因与其他 分子分离。
基因的合成方法
1
Байду номын сангаас
基因合成的步骤
2
包括设计基因序列、合成基因、验证
基因等步骤。
3
基因合成的原理
利用化学合成的方法合成目的基因的 DNA序列。
基因合成的应用
用于基因工程研究、生物医药和农业 领域，推动科学发展。
实验步骤
1. 收集目的基因样本 2. 提取目的基因DNA 3. 分离目的基因 4. 合成目的基因 5. 验证合成的目的基因 6. 分析实验结果
结果与讨论
实验结果表明电泳分离和过滤膜分离是有效的基因分离方法，基因合成技术 可用于合成目的基因。讨论了实验过程中的优缺点和改进方法。
结论和展望
基因工程中的目的基因的分离和合成方法有重要的应用价值，未来可以进一 步优化分离和合成技术，提高实验效率和基因合成的准确性。
基因工程第四章目的基因 的分离和合成
本章介绍了基因工程中的目的基因的分离和合成方法，包括电泳分离和过滤 膜分离，以及基因合成的原理、步骤和应用。
实验目的
1 了解基因工程的目的基因
明确在基因工程中需要分离和合成的目的基因。
2 掌握基因的分离和合成方法
学习电泳分离、过滤膜分离和基因合成的原理和步骤。
3 了解基因合成的应用
基因工程原理
上面都是识别6对碱基；还有识别8个碱基的如： NotI (GC↓GGCCGC). 由于切割位点不同，切割后产生的切口末端有： 平端：如EcoRV 粘端：如HindIII, KpnI等。粘端分为两种情况：5突出 和3突出。如HindIII 为3突出，KpnI为5突出。酶切后 产生的粘端退火后还可以互补。
3．II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 （1）识别序列和切割位点 绝大多数的II类限制性内切酶识别顺序长度为4，5， 6碱基对，但也有比较长的，如8，或十几个等。这些碱 基对的顺序呈回文结构，不同酶的识别序列和切割位点 是不同的。基因工程操作中常用的酶为识别6对碱基的 内切酶，如
BamHI（G↓GATCC） EcoRI（G↓AATTC） SacI （GAGCT↓C） XbaI （T↓CTAGA） KpnI （GGTAC↓C）, Hind III（A↓AGCTT） EcoRV（GAT↓ATC） XhoI （C↓TCGAG） SalI （G↓TCGAC）, ApaI （GGGCC↓C）
第四章 基因工程的一般原理
一、基因克隆所用的酶 酶是生物细胞产生的在体内外对生物化学物质起 催化作用的一类蛋白质。酶催化具有高效性、专一性 及其可调性。酶发挥作用需要最适的条件：温度、PH、 离子及其强度等。（酶的活性单位指在最适条件下在 1min 催化1 umol底物发生反应的酶量）。 生物体几 乎所有的反应是在酶的催化下进行的。 基因克隆所用的酶主要有：限制性核酸内切酶、 甲基化酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、反转录酶、磷 酸酶、RNA酶等。
（1）质粒的基本 pMB1 or ColE1 origin），因此它能独立宿主细胞的染色体DNA， 而自主复制。一种质粒载细胞的数目称为质粒的拷贝数。 不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，（复制需要的 多种酶由宿主细胞提供）根据质粒在宿主细胞所含拷贝数 得多少，将质粒分为两类：高拷贝的叫松弛型，一般在 10-60；低拷贝的叫严紧型，一般在1-3个。
基因工程的常规技术
连接酶
连接酶用于连接DNA片段，使其形成重构的基因 或载体。
多聚酶链反应
PCR技术可以迅速扩增寻找特定基因片段。
基因克隆技术
1
片段构建
选择目标基因并切割出DNA片段。
2
载体构建
将目标基因片段连接到载体上，如质粒。
3
转形
将重构的载体导入宿主细胞中。
基因变异技术
随机突变
通过暴露细菌或真核生物于突变 诱导剂，引起基因突变。
Hale Waihona Puke 定点突变使用CRISPR-Cas9等工具直接编辑 特定位点上的基因序列。
基因插入
将新的基因序列插入到生物体细 胞中，改变其特性。
基因组编辑技术
基因组编辑技术可以精确改变生物体DNA序列。常见的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9、TALEN和ZFN。
基因表达调控技术
基因表达调控技术可以控制基因的活性水平，包括转录因子修饰、RNA干扰和 放大子活性调节。
基因工程的常规技术
基因工程涉及一系列常规技术，包括基因克隆、基因变异、基因组编辑、基 因表达调控、基因组合成和基因传递技术。这些技术在各个领域都发挥着重 要作用。
常规基因工程技术
限制性内切酶
通过将DNA切割成片段，限制性内切酶在基因工 程中发挥着重要作用。
酶联免疫吸附检测
这一技术常用于检测基因表达水平，帮助研究基 因功能。
利用高速氦气或金属颗粒将基因直接转移至细胞内。
应用领域
医学
基因工程应用于疾病治疗、基因诊断和个性化药 物研发。
工业
利用微生物生产重要药物、酶和生物聚合物。
农业
通过基因编辑和转基因技术改良农作物，提高产 量和抗病能力。
基因工程的主要技术与原理
（一）、探针的标记物
非放射性探针的标记 ▪ 生物素标记核酸 （光敏生物素、酶促生物素） ▪ DNA半抗原标记 ▪ 荧光素标记
基本原理：
生物素标记法
以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、 Bio-11-dCTP）等代替相应脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺 入新合成的DNA。可以采用缺口平移法和随机引物延伸法进行。
制备高比活性探针(1010 cpm/μgDNA);
（3）末端标记法 T4 DNA聚合酶
5’→3’聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的两倍 3’→5’外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA, 其切除速度 分别为40和 4000nt/min
补平或标记DNA分子由核酸内切酶产生的3'凹端 对带有3'黏性末端或平末端的DNA片段进行标记，制备探针
基本原理 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针” 是抗体，“显色”用标记的二抗
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜）上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多 肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作 为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第 二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的 特异性目的基因表达的蛋白成分。
随机引物：含有各种 可能排列顺序的寡核 苷酸片段的混合物。 46 = 4096
DNA聚合酶ⅠKlenow片段
5’→3’DNA聚合酶活性 弱3’→5’外切核酸酶活 性 无5’→3’外切核酸酶活 性
➢ 产物平均长度为400-600个核苷酸。 ➢ Klenow片段没有5 ’→3’外切酶活性, 反应稳定, 可以获得大量的有效探针。 ➢ 反应时对模板的要求不严格, 用微量制备的质粒DNA 模板也可进行反应。
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一、凝胶电泳技术
琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳
琼脂糖是一种线性多糖,从红色海藻琼脂中提取而来的良好 的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。分辨DNA 片段的范围为0.2—50kb之间。
聚丙烯酰胺凝胶:过硫酸胺与TEMED(N、N、N`、N`-四甲 基乙二胺)是单体丙烯酰胺的催化剂和诱变剂，它们使单体 丙烯胺聚合成长链，长链与长链间就交联成凝胶，链长和 交联成决定了凝胶的孔径。分辨DNA范围为1个碱基对到 1000个碱基对之间。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团，呈离子 化状态（负电荷）。当核酸分子在电场中时，会 向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下， DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的 大小和构型。
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理
溴化乙锭——核酸分子染色剂 在凝胶电泳中,加入溴化乙锭对核酸分子染色之后， 在紫外光下观察，便可以十分敏感而方便地检测出 凝胶介质中DNA谱带。
溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入 到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长 的紫外光照射下放射出荧光，可用来显现凝胶中的 核酸分子。
一是直接在琼脂糖凝胶中加入EB，电泳完后直接 检测；也可以在电泳完后进行EB染色检测。
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理
溴化乙锭扁平分子染料插入到核酸中
2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素
（3）电泳的电压和时间 适当减低电压,可使分子筛效应相对增强而提高分 辨率。一般使用电压为100-150V。 电泳时间过长，DNA 条带易弥散；但电泳时间过 短，很多带又分不开。
2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素
（4）琼脂糖凝胶的种类 低 熔 点 （ LMP ） 琼 脂 糖 经 过 了 羟 乙 基 修 饰 。 LMP琼脂糖(熔点为62—65℃)一旦熔解,在37℃下 持续保持液体状态达数小时，在25℃下可持续保 持液体状态约10分钟。 LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用 来回收DNA分子。 一旦LMP琼脂糖已经熔化，并保持在37℃下，可 直接进行一定的酶催反应。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 (polyacrylamide gel) 是 由 单 体 (monomer)丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂 (crosslinker)N,N’- 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 (N,N’methylenebisacrylamide，简称Bis)在催化剂和加速 剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。 用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophorsis，简称PAGE)。
控制Dnase I的浓度,在双链DNA 分子一条链的有限位置打开切口，形成3’OH和5’-P末端； DNA聚合酶I结合到切口处，它的5’ 3’外切酶活性将DNA一条链的核苷酸 一个个切除，暴露出另外一条单链，以其为模板以5’ 3’聚合酶的活性将 标记的核苷酸加在3’-OH末端。
2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素
（1）凝胶的类型和浓度
琼脂糖凝胶电泳分辨大小在0.1-60kb间的DNA片 段；而要分辨较小分子质量的DNA 片段,要用聚 丙烯酰胺凝胶，它的分辨率在0.001-1kb之间。
凝胶浓度
0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.0%琼脂糖 1.2%琼脂糖 1.5%琼脂糖 2.0%琼脂糖
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理
琼脂糖电泳的基本原理:
当一种分子被放置在电场当中时,它们就会以一定 的速度移向适当的电极。电泳分子的迁移速度同 电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成 正比。
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理
电泳图谱
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理
电泳分子的迁移速度又同分子的摩擦系数成反比。 因此根据分子大小、构型或形状所带的净电荷的 不同,便可各种成分分离开来。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化,使体
系发生氧化还原作用来完成的。催化体系主要有化学催化
（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体
系。 （1）化学聚合（AP-TMTED催化体系）:TMTED是一种
脂肪族叔胺，它的碱基可催化溶液中的AP使其形成游离 氧自由基，激活Acr单体形成单体长链，同时在交联剂 Bis的作用下长链彼此交联聚合成凝胶。 （2）光聚合:催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生 自由基，催化聚合反应。一般光照2－3小时即可完成聚 合反应。
DNA片段的大小/kb
10-60 1-20 0.5-8 0.4-6 0.2-5 0.1-3
2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素
（2）缓冲液的pH值 常用电泳的缓冲液的pH一般在8.0左右,其离子强 度为0.02-0.05。 实验室常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液（TBE）与 醋酸缓冲液（TAE），TBE 的缓冲能力要高于 TAE。为防止电泳缓冲液pH和离子强度的改变， 可定期更换缓冲液。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析 蛋白质的电泳方法,特别是用于蛋白质纯度检测和 测定蛋白质分子量。
蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:
logMW=K-bX 式中:MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已
知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获 得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根 据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
第四章 基因工程的常规技术(上）
一、凝胶电泳技术
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理 2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素
二、杂交技术
1. 探针与探针标记 2. Southern杂交 3. Northern杂交 4. Western杂交 5. 菌落原位杂交
三、PCR技术
基因工程常规技术
常规的基因工程技术的研究方法:凝胶母双杂交技术等。
二、杂交技术
1. 探针与探针标记
杂交的目的是为了检测出同源DNA 序列,为了达 到这一目的，需要使用有标记的探针。
探针:带有能检测的标记物的DNA或RNA片段称 为探针。
探针标记:使DNA或RNA 带有可检测的标记物的 过程叫探针标记。
1. 探针与探针标记
（1）切口平移标记（nick translation）