利用染色质免疫共沉淀测序研究Twist1结合的靶DNA序列_孙涛

移和血管生成拟态形成的关系最为密切。Twist1 与 经典的“锌指蛋白”家族转录因子 SNAI1 和 SNAI2 不同，前者表现为对 DNA 的双向调节，而后者则主 要表现为 DNA 的负向调节作用。本研究的前期工 作 发 现 Twist1 可 与 参 与 肿 瘤 细 胞 E- cadherin 和 VE- cadherin 表型的颠换，并且可与 抗 凋 亡 分 子 Bcl- 2 发生直接相互作用并介导其入核[7-8]。这些工 作均提示 Twist1 的功能可能非常复杂，本研究从转 录调节水平研究 Twist1 的 DNA 结合区域，为深入 探讨 Twist1 的相关分子机制奠定基础。 1 材料与方法 1.1 细胞系、质粒和抗体 选择目前文献报道较为 公 认 的 肝 细 胞 肝 癌 细 胞 系 HepG2、Bel7402、PLC、 SMMC7221 和 Huh- 7，其中 Bel7402 为天津环湖医 院细胞室保存（引自中科院上海细胞所），其余细胞
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天津医科大学学报
第 18 卷
系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国）。细 胞 培 养 采 用 Dulbecco’s modified Eagle’s medium （DMEM）添加 10%胎牛血清，均购自 Invitrogen 公司 （美国）。培养条件为 37 ℃，5%CO2 恒湿环境培养。
Twist1 表达质粒：CDS 全长通过全基因合成方法 获得，亚克隆入 pcDNA3.1，酶切位点为 XbaI/BamHI， 由 GeneScript 公司完成。 1.2 免疫印迹 细胞传代消化，待贴壁后进行转 染，36 h 后收集细胞并以 RIPA 裂解液 （50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1% Triton，0.5%脱氧胆酸钠和 蛋白酶抑制剂） 裂解细胞，8% SDS- PAGE 分离蛋白 后湿转至 PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭，室温杂交 一抗（Twist1，Santa cruz 公司），随后杂交二抗后进行 化学发光检测。内参选择 β- actin（Santa cruz 公司）。 1.3 染色质免疫共沉淀（ChIP）及测序 以甲醛固 定细胞以使 DNA 与蛋白质交联，裂解细胞并利用 超声将基因组 DNA 打断至 100~500 bp；以 Twist1 抗体进行免疫沉淀，在免疫沉淀复合体中加入不含 DNase 的 RNase 和蛋白酶 K，65 ℃保温 6 h 以上，使 交联逆转。交联逆转后用 QIAquick DNA cleanup system 纯化回收 DNA，纯化的 DNA 进行微定量。对 纯化的 DNA 进行末端修复、3′端加 A 碱基，链接测 序接头后行 PCR 扩增并构建文库用于测序（测序由 深圳华大基因公司完成）。 1.4 结果分析方法 对测序结果进行去污染、去接 头处理。测序获得原始图像数据转化为序列数据并 统计数据产量；对原始测序结果中低质量序列予以 剔除，与人基因组序列进行比对，允许不超过 2 个 碱基的错配，使用 UCSC 已知信息对数据进行注释， 计算外显子、内含子和保守非编码区域的比例，绘 制分布图；对数据中重复序列的基因分布进行统 计；分析 TSS 转录起始位点附近的数据分布特征； 计算全基因组中每 50 bp 窗口的数据覆盖深度；对 数据信号峰进行 GO 富集分析，对筛选到的基因按 功能进行聚类。 2 结果 2.1 高表达 Twist1 细胞 系 的 筛 选 和 Twist1 过 表 达 对 HepG2、Bel7402、PLC、SMMC7221 和 Huh- 7 等 5 种细胞系进行 WB 蛋白定量分析 Twist1 表达 量，结果显示 HepG2 表达 Twist1 且表达量适中，因 此用于后续的 Twist1 过表达模型的建立。对 HepG2 转染 Twist1 表达质粒，可观察到其 Twist1 水平显著 上调。 2.2 染色质免疫共沉淀测序结果 样品两个，为过 表达 Twist1 的 HepG2（T）和共表达 Twist1/Bcl- 2 的
论著
孙 涛 1，孙保存 1，2，赵秀兰 1，赵 楠 1，古 强 1，董学易 1，车 娜 1，池嘉栋 1 （1. 天津医科大学病理学教研室，天津 300070；2. 天津医科大学附属肿瘤医院病理科，天津 300060）
摘要 目的：利用染色质免疫共沉淀测序研究 Twist1 结合的靶 DNA 序列，比较过表达 Bcl-2 和正常状态下 Twist1 结合靶 DNA
序列的变化。方法：筛选常态表达 Twist1 的肝癌细胞系，分别转染 Bcl-2 表达质粒和对照空载体，收集转染后细胞以甲醛交联
DNA，收集样品进行染色质免疫共沉淀，获得与 Twist1 蛋白结合的 DNA 片段进行测序分析。结果：通过对 5 种肝癌细胞系进行
筛选，观察到 HepG2 可表达 Twist1，其与 DNA 结合序列在空载体对照组和 Bcl-2 过表达组具有很大的差别，结合 DNA 数量分
基金项目 国家自然科学基金重点资助项目（30830049）；国家自然 科学基金面上资助项目（81172046）；天津市科技支撑资助项目（中 瑞合作，09ZCZDSF04400） 作者简介 孙涛（1982-），男，讲师，博士，研究方向：肿瘤病理学；通 信作者：孙保存，E- mail：sunbaocun@yahoo.com.cn。
别为 68 条和 212 条，其中共享序列 154 条。结论:Twist1 在不同环境下与 DNA 结合位点多达 212 个，涉及粘附分子、细胞骨架、
信号转导、代谢和转录调节等多种生物学功能。
关键词 Twist1；染色质免疫共沉淀；靶 DNA 序列
中图分类号 R392.3
文献标志码 A
Using chromatin immunoprecipitation to study the target DNA binding sequences of Twist1
第 18 卷 3 期 2012 年 9 月
天津医科大学学报
Journal of Tianjin Medical University
Vol． 18, No． 3
Sep． 2012
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文章编号 1006－8147（2012）03-0281-04
利用染色质免疫共沉淀测序研究 Twist1 结合的 靶 DNA 序列
利用 UCSC 数据库对唯一比对 reads 进行注释， 分析唯一比对 reads 在重复序列区域的分布特征，结 果如图 1。进一步计算 reads 在各基因功能元件上的 分布，包括基因间区、基因内含子区、基因外显子区、 基因上游 20K 和基因下游 20K，结果如图 2。从各样 品随机抽取相同数量的 reads （可比对到参考基因 组），然后计算全基因组上每一个 50 bp 大小的窗口 里面的 reads 覆盖情况，结果见图 3。
HepG2（BT），细胞经过 ChIP 的 DNA 进行测序，通过 去除污染和去接头处理，获得原始数据序列（reads）， 其总数为 1 258 912 条，产量 616 562 688 bp。对获 得的 reads 进行低质量信号去除，收率为 98.84% （T），98.7%（BT）。
将除去低质量信号的 reads 与人类基因组序列 进行对比，能在人类基因组上定位的对比率分别为 95.98%（T）和 94.91%（BT），能在人类基因组唯一位 置定位的对比率分别为 84.78%（T）和 84.48%（BT）。
40.00
35.00
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T
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定位信号强度百分比 /%
定位信号强度百分比 /%
40.00 35.00 30.00 25.00
BT 20.00
15.00 10.00 5.00 0.00
唯一定位信号强源自文库百分比 /% 唯一定位信号强度百分比 /%
图 1 唯一比对数据序列在重复序列区域的结合分布 Fig 1 Unique mapped reads in repeats
上皮间充质转变 （epithelial- mesenchymal transition，EMT） 是研究果蝇胚胎发育中观察到的细胞 跨胚层分化的生物学现象[1]。在多细胞动物发育早 期的内胚层和原肠形成中，EMT 起着重要的作用[2]。 EMT 既指细胞由上皮表型向间充质表型的转变，又 存在细胞功能的改变，这在肿瘤生长和演进、慢性炎 症、纤维化等病理过程中也扮演着重要的角色[3- 4]。 Twist 蛋白是近年来被重新认识的与 EMT 相关的重 要转录因子[5- 6]，其属于碱性环袢环（bHLH）家族，包 括 Twist1 和 Twist2 两个亚型，其中 Twist1 与肿瘤转
SUN Tao1, SUN Bao-cun1,2, ZHAO Xiu-lan1, ZHAO Nan1, GU Qiang1, DONG Xue-yi1, CHE Na1, CHI Jia-dong1 （1. Department of Pathology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2. Department of Pathology, Cancer Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300060, China） Abstract Objective: To compare the difference of the target DNA binding sequences of Twist1 in cells that overexpress Bcl-2 or not using chromatin immunoprecipitation. Methods: The hepatocellular carcinoma cell lines was screened and the cell line with normal twist expression was selected. Cells were transfected with Bcl-2 expression plasmid and control empty vector. After formaldehyde cross-link－ ing, chromatin immunoprecipitation was performed to get the target DNA binding sequences of Twist1 to be sequenced and analyzed. Results: After screening of 5 hepatocellular carcinoma cell lines, HepG2 was observed to express twist. There was a significant difference of the target DNA binding sequences of Twist1 in cells that overexpress Bcl-2 or not. The amount of binding-DNA was 68 and 212, re－ spectively. At the same time, they shared 154 sequences. Conclusion: There are 212 DNA binding sequences of Twist1 in different mi－ croenvironment, involving adhesion molecules, cytoskeleton, apoptosis, cell motility and migration and other biological functions. Key words Twist1; chromatin immunoprecipitation; target DNA seguences