慢病毒包装原理 介绍

精品文档慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途型病毒）为基础发展起来的基 I HIV-1 （人类免疫缺陷慢病毒（ Lentivirus ）载体是以慢它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主研究的也非常深入。病毒载体的研究发展得很快，心肌从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、染色体上，细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差， RNAi 目前慢病毒也被广泛地应用于表达对基因表达的抑制作用通常是短暂的，半衰期短，体外合成 siRNA 转移到细胞内的 siRNA

的载体，然后转移到因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA

的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制细胞内转录 siRNA

，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断效果也不逊色于体外合成 siRNA

合聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 表达载体中，是由 RNA siRNA 基因表达的作用。在所构建的poly A RNA 不会带成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 3' 在转录产物 T 时，它指导的转录就会停止，聚合酶Ⅲ遇到连续当 RNA 4 个或 5 个尾。聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是 RNA H1 RNA 启动子是两种和 1~4 个U 。 U6 端形成茎环结构

50ntRNA 21ntRNA 和～启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～的正义与反义链，可由各自的启动 siRNA siRNA 表达载体中，构成（ stem loop ）。在 RNA(small siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状子分别转录，然后两条链互补结合形成转录终止位点之间～ 5 T，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 hairpin RNA, shRNA)突出端的茎环结构，在细胞内进一' U 1~4 个3 的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有，然后 siRNA 。构建载体前通常要通过

合成 siRNA 的方法，寻找高效的步加工成 siRNA

表达载体。从中挑选符合载体要求的序列，将其引入 siRNA

）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有 Lentiviral vector 慢病毒载体（的高滴度的慢病毒，慢病毒载体能够产生表达 shRNA 效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。，实现在多在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA

为在原代的人和动物细种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒包装质粒可提供所稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒表达载体包含了包装、转染、到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗有的转录并包装 RNA

包装好的假在细胞中进行病毒的包装，粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，目离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。精品文档．

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二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题：

1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为 RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。

2. 进行稳转细胞株的筛选；

3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；

在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。

三、慢病毒载体介绍

慢病毒载体（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因（或 RNAi ）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链 RNA ，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为 DNA ，形成 DNA 整合前复合体，进入细胞核后， DNA 整合到细胞基因组中。整合后的 DNA 转录

mRNA ，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生 RNAi 干扰。

慢病毒载体介导的基因表达或 RNAi 干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。

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蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫 HIV-1 慢病毒载体不表达任何次注射。反应也较低，不影响病毒载体的第 2

四、慢病毒载体的构建构建原理1.

个和单纯逆转 3 和 env 这但其基因组结构复杂，除 gag、pol 慢病毒属于逆转录病毒科， tat 个调节基因和 2 vpr、nef、vpu 4 录病毒相似的结构基因外，还包括个辅助基因，vif、是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基 HIV 21 rev 。和如包装( HIV 21 基因组中的顺式作用元件础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和 ) 信号、长末端重复序列基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构21 载体成分：包装成分由 HIV

逆转录和含有包装、建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插 HIV 21整合所需的的可能性，将包装 (RCV ) 入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒 SV 40 polyA LTR 换成 (CMV ) 立即早期启动子，3 ′成分的 5 ′ LTR 换成巨细胞病毒。、另一个表达 env gag 和 pol位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达 Kafri 等构建了三质粒

表达系统。根据这个原理，Naldini 和三质粒表达系统2.

启动子的 CMV 三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白控制下，表达 HIV 21

包膜的假构型慢2G ，应用 VSV (V ；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白SV 2G)vpu允许通过高速离心对载而且增加了载体的稳定性，病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保体进行浓缩，提高了滴度；。将绿色荧光蛋白 GFP) 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因 ( 的留 350 bp gag

载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生9。细胞，超速离心后病毒滴度可达 293T 10IU /m l RCV 的可能性。通过三质粒共转染四质粒表达系统3.

等人将Dull RCV 的可能性，为了减少 HIV 21 包装结构的序列同源性，进一步减少重组成，

因此，在上述的三质粒系统的基础上，的转运需要 rev辅助基因去除。但由于 gag2pol

而且对非分的可能性，的质粒减少了产生该系统加上含 rev RCV 构建成四质粒表达系统，裂期细胞转导效率无影响。五、慢病毒载体应用干细胞或其它原代细胞；比如神经元细胞、1. 将目的基因 /RNAi 基因转入难以转染的细胞，