弧菌及弯曲菌

• ⒊ 鸡红细胞凝集试验： 在玻片上滴加生理盐
水一滴，取被检菌18-24h培养物少许在盐水中制成浓厚 菌悬液，然后加一滴2.5％鸡红细胞悬液，充分混匀， 1min内出现 凝集者为阳 性，红细胞 呈均匀分散 者为阴性。 El Tor生物 型为阳性， 古典型为阴 性。
鉴定要点：
确诊O1群霍乱弧菌必须具备的条件：
• 能产生靛基质，霍乱红反应阳性
El Tor型霍乱弧菌与古典型霍乱弧 菌生化反应有所不同
• El Tor型V－P试验为阳性，能产生强烈的溶血素， 溶解羊红细胞，在血平板上生长的菌落周围出现
明显的透明溶血环，
• 古典型试验V－P试验为阴性，不溶解羊红细胞。
• 个别EL Tor型霍乱弧菌株亦不溶血。
（四）抗原性
（二）培养特性
• 为微需氧菌，在含2.5～5%氧和10%CO2的环境 中生长最好。最适温度为37～42℃。在正常大 气或无氧环境中均不能生长。 • 本菌营养要求高，需加入血液、血清才能生长。
3）涂片染色： 革兰氏染色阴性 并成鱼群状排列的弧菌。
2．快速诊断：
1） 免疫荧光菌球法：将标本接种于含有霍乱弧菌荧
光抗体的碱性蛋白胨水中，经37℃4～6h，如有霍乱 弧菌，在荧光显微镜下可见发荧光的菌球。本法适 用于做大量标本的初筛。
2） SPA协同凝集试验：以霍乱弧菌IgG型抗体与
SPA阳性葡萄球菌结合作为试剂，与米泔水样便或 增菌液作玻片凝集，立即出现明显凝集者（＋＋＋） 为阳性。
血清型：
O1群霍乱弧菌的菌体抗原由A、B、C三个抗原成份组成 O1群霍乱弧菌的血清分型
型别
原型 异型 中间型
别名
稻叶型（Inaba）
O抗原成份
A、C
小川型（ Ogawa ） A、B 彦岛型 （Hikojima） A、B、C
• 生物型： O1 群霍乱弧菌有古典生物型和 E1 Tor 生物型之分，两个生物型具有相 同的血清型。我国流行以El Tor、小川型 霍乱弧菌为主。 • 噬菌体分型： 对噬菌体的敏感性进行分 型，其中较为实用的是第Ⅳ组和第Ⅴ组 噬菌体。
第二部分 弯曲菌属
• 弯曲菌属 (Campylobacter) 细菌是一类微需氧、 不分解糖类、氧化酶阳性、菌体弯曲呈逗点状、 S型或螺旋状、有动力的革兰氏阴性菌。 • 对人类致病的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌 胎儿亚种，前者是人类腹泻最常见的病原菌之 一，后者在免疫功能低下时可引起败血症、脑 膜炎等。 • 本节主要以空肠弯曲菌介绍本属的生物学特性 和检验方法
一、生物学性状
（一）形态与染色 空 肠 弯 曲 菌 （ C.jejuni ） 菌 体 轻 度 弯 曲 似 逗 点 状 ， 长 1.5 ～ 5 μm ，宽 0.2 ～ 0.8 μm 。菌 体一端或两端有鞭毛，运 动活泼，在暗视野镜下观 察似飞蝇。有荚膜，不形 成芽胞。革兰氏阴性。
图注：空肠弯曲菌的两端单鞭 毛（↑） 负染，×21 000
大量脱水和失盐
发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡
2．所致疾病
• 引起烈性肠道传染病的霍乱，为我国的法定传染病（甲类），表 现为剧烈的上吐下泻，导致严重的脱水、酸中毒、痉挛、尿闭、 休克和死亡。 • 人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水 源或饮食物经口传染（粪口途径）。患者出现上吐下泻，泻出物
1、涂片为革兰氏阴性弧菌或杆菌； 2、TCBS等选择培养基上典型的菌落特征； 3、动力阳性； 4、O1群霍乱弧菌诊断血清凝集试验阳性。
四、防治原则
• 必须贯彻预防为主。 • 人群的菌苗预防接种，可获良好效果，
• 治疗主要为及时补充液体和电解质及应用抗菌
药物如四环素、链霉素、氯霉素、强力霉素及 氟哌酸类抗生素药物。
③ O/129敏感试验：将O/129（2，4二氨基－6，7－二异
丙基喋啶）药敏纸片（10－150μ g）贴在接种有待测 菌的琼脂平板上作纸片扩散试验，凡药物纸片周围出 现抑菌环者为敏感。
4） 霍乱弧菌的分型鉴别试验： ①血清分型：用小川型和稻叶型单价诊断血清作玻
片凝集。与小川型血清凝集而与稻叶型血清不凝集者 为小川型，反之为稻叶型。在两个单价血清中均有明 显凝集者为彦岛型。
霍乱弧菌两个生物型的鉴别
性 状
溶血（1%绵羊红细胞） 血凝（2.5%鸡红细胞） V-P试验 多粘菌素B敏感试验 （50U/片） 噬 菌 体 Ⅳ 组 裂 解 （106/ml） 噬 菌 体 Ⅴ 组 裂 解 （106/ml）
古典型
－ － － ＋ ＋ －
E1 Tor 型
d ＋ ＋ － － ＋
＋ ９０％以上为阳性；－ ９０％以上为阴性；ｄ １０－８９％阳性
弧菌和弯曲菌
医学检验系临床微生物及免疫学教研室
井申荣
第一部分
弧菌
概 述
• 弧菌科（Vibrionaseae）包括一群氧化酶阳性、具有端 极鞭毛、动力阳性的细菌，有4个菌属，其中，弧菌属 是一群氧化酶阳性，发酵葡萄糖，对弧菌抑制剂O/129
（二氨基二异丙基喋啶）敏感的细菌。
• 弧菌属(Vibrio)广泛分布于自然界，尤以水中为多，有 100多种。主要致病菌为霍乱弧菌和副溶血弧菌（致病 性嗜盐菌）。前者引起霍乱；后者引起食物中毒。
图注：分裂中的 霍乱弧菌 冰冻蚀 刻，×70 000
（二）培养特性
• 霍乱弧菌为需氧或兼性厌氧菌;
• 营养要求不高，耐碱不耐酸，在pH8.8～9.0的碱 性蛋白胨水或平板中生长良好。因其他细菌在这 一 pH 不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性 增殖霍乱弧菌的培养基;
• 在碱性平板上菌落直径为 2mm ，圆形，光滑，
呈“米泔水样”，并含大量弧菌，此为本病典型的特征。
3．免疫性
• 患过霍乱的人可获得牢固的免疫力，再感染者 少见。 • 病后小肠内可出现分泌型lgA。
三、微生物学诊断
• 由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死 亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的 诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。
（一）标本采集： 标本以粪便为主， • 一般米泔水样便采取1－3ml，成形便采取蚕豆 大小。 • 在某些情况下，亦可采取呕吐物和尸体肠内容 物作检材。
可疑菌落进行鉴定。鉴定以血清学（玻片凝集）为主，
结合形态学、生化反应作出判断。
1） 玻片凝集试验：从分离培养基上挑取可疑菌落于霍 乱弧菌多价诊断血清作玻片凝集试验。诊断血清应稀 释成 1:32-1:64 的效价使用，立即出现凝集者为阳性， 同时设生理盐水和阳性细菌株对照。
2） 形态学检查：取纯培养物涂片革兰氏染色，观
化酶的酶活性
结合B亚单位； 参与转位
5个B亚单 结合 位（4～6） 单位
特异地识别肠上皮细胞膜上的 神经节苷脂受体
源自文库
致病机理
霍乱弧菌
胃 肠
鞭毛、菌毛、粘液素酶 对酸敏感，很快被杀死
胃酸降低或缺乏，菌体增多
绒毛上大量繁殖
CT的B亚单位结合神经节苷脂受体
形成膜通道
A1肽链进入细胞
激活腺苷酸环化酶系统 ATP → cAMP↑ 肠粘膜上皮细胞分泌亢进 肠液大量分泌 大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻
3．细菌分离培养
1） 直接分离培养：
• 分离用的培养基有强、弱2种选择培养基。
• 弱选择培养基：碱性琼脂和碱性胆盐琼脂。 • 强选择培养基：常用的有庆大霉素琼脂、4号琼脂和 TCBS琼脂等。
• 现多采用碱性蛋白胨水增菌，再用强选择培养基进行 分离。
4． 鉴定：
根据霍乱弧菌在各种选择培养基上的特点，挑选
一、生物学性状 （一）形态染色
• 霍乱弧菌呈弧形或逗点形态，大小为 1.4~2.6×0.5~0.8μm 。革兰氏阴性菌，菌体一 端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞。 • 取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察，可
见细菌运动极为活泼，呈流星穿梭运动。
图注：霍乱弧菌的鞭 毛（↑）和它可溶解 的鞘膜（↑↑） 负染， ×3 100
（五）变异性：
形态变异 弧型→直杆状→ 多形
霍 乱 弧 菌 的 变 异 性
菌落变异
溶血性变异 （ El Tor型） 毒力变异
S ←→R←→L
溶血性 ←→非溶血性 传代 强毒株←→ 弱毒株 ←→无毒株
血清型别变异 小川型←→ 稻叶型
（六）抵抗力
• 霍乱弧菌古典生物型对外环境抵抗力较弱， EL-Tor生物型抵抗力较强。 • 霍乱弧菌对热、干燥、日光、化学消毒剂和酸 均很敏感，耐低温，耐碱而不耐酸。 • 霍乱弧菌对链霉素、氯霉素和四环素敏感，但 El Tor生物型对一定浓度的多粘菌素B及庆大霉 素有耐药性。
二、致病性和免疫性
1．致病物质
（1） 鞭毛、菌毛、粘液素酶
（2） 霍乱肠毒素（cholera enterotoxin） 霍乱肠毒素本质是蛋白质，不耐热。对蛋 白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗。 该毒素属外毒素，具有很强的抗原性。
A1肽链
具有激活腺苷酸环
霍 乱 肠 毒 素
1个A亚单 毒性
位 单位 A2肽链
② 霍乱红试验： 出现蔷薇色，为霍乱红试验阳性。由于
霍乱弧菌和其他弧菌均有此种反应，故无特异性。 （霍乱弧菌含有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，霍 乱弧菌液能还原硝酸盐为亚硝酸盐，因此当霍乱弧菌 培养在含有硝酸盐成分的蛋白胨水中，所产生的亚硝 酸盐可与吲哚结合成亚硝酸吲哚，滴加浓硫酸即可出 现蔷薇色，称为霍乱红试验阳性）
型别除个别生物学性状稍有不同外，形态和免疫学性基本相同， 在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别。自1817年以来， 全球共发生了七次世界性大流行，前六次病原是古典型霍乱弧菌， 第七次病原是埃尔托型所致。
1992年10月在印度东南部又发现了一个引
起霍乱流行的新血清型菌株（0139），它 引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古 典型霍乱完全相同，但不能被01群霍乱弧 菌诊断血清所凝集。该菌株在水中的存活 时间较01群霍乱弧菌长，因而有可能成为 引起世界性霍乱流行的新菌株。
透明。
• 常用的选择培养基为硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖 琼脂平板（TCBS），霍乱弧菌在其中可形成较大的菌 落，因发酵蔗糖产酸而使菌落呈黄色。
（三）生化反应
• 两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、 麦芽糖，产酸不产气。迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖。
• 氧化酶、明胶酶试验均阳性。
检验程序
（三）检验方法及鉴定
1．直接镜检：
1）动力观察：采取病人“米泔水样”大便或呕吐物制成 悬滴片，观察细菌动力，可见流星或穿梭状动力的细菌。 2）制动试验： • 标本， 霍乱多价诊断血清（效价1：64），用暗视野 镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性， • 此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多 的弧菌才检出。
霍乱弧菌
霍乱弧菌（ V.cholera ）是人类霍
乱的病原体，霍乱是一种古老且流行
广泛的烈性传染病之一。曾在世界上
引起多次大流行，主要表现为剧烈的
呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高。属
于国际检疫的烈性传染病。
• 霍 乱 弧 菌 包 括 两 个 生 物 型 ： 古 典 生 物 型 （ Classical biotype）和埃尔托生物型（ EL-Tor bio-type ）。这两种
1．抗原结构：
霍乱弧菌的抗原结构
特性
属共同抗原 群特异性 型特异性 耐热性 （100℃ 2h）
O抗原
H抗原
＋
＋ ＋ ＋
－ － －
2．分群和分型：
• 根据O抗原的特异性，可将霍乱弧菌分成139个血清群。
• 根据是否与O1抗血清凝集分两大群， 凡能与O1群抗血清发生凝集的称为O1群霍乱弧菌； 凡不被O1群抗血清凝集的其它血清群统称为非O1群霍 乱弧菌。
察菌体形态及染色性。用悬滴法或半固体穿刺法检测 动力。
3） 生化反应：霍乱弧菌氧化酶试验、靛基质试验、 粘丝试验和霍乱红试验均阳性。 ①粘丝试验：用于测定霍乱弧菌形成粘丝的特
性。将0.5％去氧胆酸钠水溶液于霍乱弧菌混匀制成浓 厚菌液，1min内悬液由混变清，并变得粘稠，以接种 环挑取时可以拉出丝来。霍乱弧菌古典生物型和El Tor 生物型均呈阳性。
②生物型别的鉴定：目前，两型主要依靠第Ⅳ组
霍乱噬菌体裂解试验进行鉴别，并辅以多粘菌素敏感 试验、鸡红细胞凝集试验、V－P试验和溶血试验。
⒈ 第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验：
第Ⅳ组霍乱噬菌体常规稀释液（ 106/ml ）一般仅裂 解古典型，而不裂解El Tor型。
⒉ 多粘菌素B敏感试验：
取被检菌2-3h肉汤培养物点种到含药营养琼脂平板 上（多粘菌素B50U／ml）,37℃培养24h，El Tor生物 型生长，而古典型敏感。