两种测定蛋白质含量方法的实验比较目的要求(1)学习双

• 蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也 能与Cu2+形成紫红色络合物。其颜色深浅与蛋 白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基 酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适 于1~10mg /mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速 测定。
紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：
二、紫外吸收法：
蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使 蛋白质在280nm波长处有最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质 溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。
V
其中,Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/mL），N为稀释倍数， V为血清样品所取的体积（mL），c为样品原浓度（mg/mL）。
注意事项
（1）须于显色后30min内比色测定。各管由显色到比色的 时间应尽可能一致。 （2）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混 合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液 再测定。 （3）由ห้องสมุดไป่ตู้各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显 色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只 适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。此外 蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时也会影响紫外吸收法测定蛋 白质含量的准确性。
思考题
1．干扰双缩脲实验的因素有哪些？ 2．若样品中含有核酸类杂质，应该如何校正实验结
果？ 3. 试比较两种常用蛋白质定量测定方法的优缺点。
紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品， 低浓度盐类不干扰测定。因此，广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗 脱情况的检测。
此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色 氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中核酸 等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测 定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步定量的依据。该法可 测定蛋白范围应在0.1~1.0mg /mL。
两种测定蛋白质含量方法的实验比较
目的要求
（1）学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。 （2）学习紫外吸收法测定蛋白质的原理和方法。 （3）比较两种测定蛋白质方法的优缺点。
实验原理
一、双缩脲法：
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。 在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复 合物其最大光吸收在540nm处。
• 试剂：
双缩脲试剂：
试剂和器材
• 材料
1. 标准蛋白溶液 两种浓度的结晶牛血清白蛋白
溶液(BSA)。
2. 待测蛋白质溶液 人血清（稀释适当倍数，使其浓 度在标准曲线测试范围内。）
操作方法
一、制作标准曲线 二、样品测定
三、计算 取两组测定的平均值计算：
YxN 血清样品蛋白质含量（mg/100mL）=