漆酶结构与催化机理

漆酶结构与催化机理

万云洋杜予民#

（中国石油大学（北京）资源与信息学院北京 102249 #武汉大学资源与环境科学学院武汉 430079）

摘要本文阐述了漆酶的研究进展，对漆酶研究中的铜离子活性中心、三维结构和催化机理研究作重点阐述。

关键词漆酶金属酶三维结构三核中心催化机理

Structure and Catalytic Mechanism of Laccases

Wan Yunyang, Du Yumin#

(Faculty of Natural Resources and Information Technology, China University of Petroleum, Beijing, 102249; # College of Resource and Environmental

Sciences, Wuhan University, Wuhan 430079)

Abstract The progress on the research of laccases is reviewed the active centre of copper ions, the three-dimensional structure of protein, and catalytic mechanism are emphasized in this paper.

Key words Rhus laccase, Metal enzyme, Three dimensional structure, Trinuclear centre, Catalytic mechanism

漆酶(EC1.10.3.2)，(对)-二酚：双氧氧化还原酶，是多铜氧化酶中的一种含铜的糖蛋白氧化酶(表1)，按照来源大致可以分为植物漆酶、微生物(包括真菌和细菌)漆酶和动物漆酶[1]。从首次在生漆液成份中发现这种酶成份(1883年)、漆酶(laccase)概念的提出(1898年)与沿用、真菌漆酶的发现、含铜蛋白质和铜活性中心地位的确立，到第一种工业微生物漆酶制剂的应用(1997年)[2]，及对漆酶分离纯化[3,4]、晶体结构[5,6]等的研究，已有一百多年的历史，并一直经久不衰，几乎涉及到化学、分析、食品、医疗、生物和环保等各个领域，同时预计它在新兴的蛋白质组学对糖蛋白的研究中也会有一席之地。本文结合自身工作实践，对漆酶研究中的难点热点之一的铜离子中心和高级结构以及其多样化的应用研究作一综述，以期推动漆酶(尤其是植物漆酶)研究的深入发展。

表1 几种益多铜酶

Table 1. Several kinds of blue multicopper enzymes

铜酶作用原子数分子量主要来源

tyrosinase 底物氧化 4 116,000~128,000 植物真菌细菌

Laccase 底物氧化 4 101,000~140,000

50,000～90,000

植物

真菌

Ascorbate oxidase 底物氧化 8 ~140,000 植物

ceruloplasmin Fe2+氧化 8 ~151,000 动物

1漆酶的结构与功能

植物漆酶与其他来源的漆酶有共性也有区别(表1、表2)，特别由于真菌漆酶研究的飞速发展，比较借鉴它们的相互特性，对植物漆酶、尤其是漆树漆酶的研究无疑是有益的。从目前的发展来看，由于漆树漆酶本身存在的一些问题，目前尚难以解决，所以漆树漆酶还须同真菌漆酶结合起来研究。比如从表2可见，在底物专一性、pH、p I和分子量上两者都有差异，但一些抑制剂对它们的作用却类似。从目前的研究来看，它们最大的共性可能是具有4个铜离子(但不是绝对)的活性中心相对保守的结构组成。而在氨基酸和糖成分组成上存在着较大的区别。这在下面的论述中也有提及，包括氨基酸，糖链及其组成和空

2006-09-27收稿，2007-04-09接受

间结构差异等。结构决定功能，漆酶作为一种最简单的多铜氧化酶，尤其是漆树漆酶，一直是生物化学家关注和研究的热点。

表2 真菌漆酶与植物漆酶的比较

Table 2. Comparison of fungal laccase and plant laccase

真菌漆酶植物漆酶

Mw 50,000~90,000 101,000~140,000

有利的 pH 酸性中性-碱性

最佳温度/°C - 35~40 pI 3~5 7~9

铜原子数 4 4

活性高低

抑止剂二乙基二硫代氨基甲酸酯，氰化物，叠氮化物，EDTA

1.1. 漆酶的高级结构

从Coprinus cinereus中获得漆酶，并将其在Aspergillus oryzae上表达，然后用获得的晶体进行研究，Ducros等[7]预测并最早描绘出漆酶的三维草图(图1b)。但是图中T2铜已经被选择性去掉。

Hukulinen等[6]则从M. albomyces中获得有很高热稳定性、最适pH在中性范围的漆酶的结晶，并直接获得含四个铜原子活性漆酶蛋白的三维结构(图1a)。其C-端深埋于蛋白质内，可能会阻止所谓的氧通道。这种漆酶同担子菌漆酶只有20~30%序列相似，同C. cinereus漆酶的相似性为26％。图中灰色链状结构表示糖链。

图1 M. albomyces漆酶(a) [6]和去掉了T2的 C. cinereus漆酶(b)的三维晶体结构[7]

Figure 1. Three-dimensional crystal structure of the M. albomyces laccase (a) [6] and T2-depleted C. cinereus laccase (b).[7]

除此之外，Trametes versicolor[8~10]、Pleurotus sapidus和Rigidoporus lignosus[11]等真菌漆酶, 以及一种Bacillus subtilis[5]细菌漆酶的三维结构均已接连被报道，虽然只占已报道漆酶的极小部分。

目前报道的酶都具非常相似的保护金属离子和调节其反应活性的蛋白质包封结构，其折叠一般称作杯蛋白(cupredoxin)型[12,13]，与图1所示漆酶相似，相对的分成三区，每区均具有β-圆桶状(由β-绳带排成β-折页形成所谓的希腊图状)拓扑构型。如图1所示，红色区(I区)包含1-157号氨基酸残基，参与对三核位的连接；绿色区(II区)包含158～341号氨基酸残基，是底物结合部位；蓝色区(III区)包含342～559号