生物大分子制备
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
18
2.基本过程： 固相化:将配基以共价键连接于不溶于
水的固相基质上制成固相化吸附剂 (Immobilise)
Baidu Nhomakorabea
配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆 结合的生物专一性物质。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的 物质。 吸附 (Adsorption) 解吸 (Elution )
13
精制(进一步分离)方法(层析法和凝胶电泳)
1. 2. 3. 4. Ion exchange chromatography Molecular sieve chromatography Affinity chromatography(亲和层析) Hydrophobic interactionchromatography （疏水相互作用层析）
16
2.Affinity chromatography
是利用生物大分子之间有专一的亲和力而达到分 离纯化的层析方法
具有专一性亲和力的生物分子对： 酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅酶 因子） 特异性抗原—抗体 激素—受体 DNA—互补的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白
17
1. Substrate analogue affinity chromatography
11
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： ⑴中性盐沉淀（盐析法）： 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 ⑵有机溶剂沉淀： 多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的 分离纯化。 ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）： 多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性 的杂蛋白。 ⑷等电点沉淀： 用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此 法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 ⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇 （Polyethyene glycol）作为沉淀剂。 12
•
separates proteins based on differences in hydrophobicity •absorb proteins to hydrophobic matrix high salt promotes
• hydrophobic
interactions eg, 1 M (NH4)2SO4
5. 双缩脲法
28
六. 蛋白质的纯度鉴定
主要方法： 1. SDS-PAGE 2. PAGE 3. IEF 4. HPLC 5. Analysis of N-terminal AA 6. Other methods
29
Specific activity(比活)= ？
30
31
32
33
34
35
四、生物大分子的分离纯化
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万
种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适
合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关 键部分的基本手段是相同的。
为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和
借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和
技术有：
沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀 等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层
26
5. HPLC (High Performance Liquid
Chromatography )
ADSORBENT PARTICLE
五 蛋白质含量的分析
1. 紫外法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸 收。 2. Lowry法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合 物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸－磷钨酸试剂产 生蓝色。 3. Bradford法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量。 4. 凯氏定氮法
20
21
Large protein Small protein
Applications: 1. purification 2. desalting 3. size determination
Short path length
Longer path length
22
23
Calculating Size
8
⑵ 有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧 链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、 或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正 丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶， 同时具有亲水性和亲脂性。 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶 于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这 种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防 止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效 果的作用。 9
然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细
致而困难的工作。
2
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行
①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行R & D、还是
要发现新的物质。 ②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关 键。 ③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物
理化学性质。
④生物材料的破碎和预处理。 ⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，根据起用途
建立相应的方法。 ⑦产物的浓缩，干燥和保存。
3
分析测定的方法
(即生物学和物理、化学方法)
生物学的测定法主要有：
酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、 免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；
析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制
备电泳等。
10
初步分离方法(沉淀法)
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅 用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时 最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入 固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不 同而达到分离的目的.
Affinity ligand Enzyme
+
Matrix Spacer arm
Active-site-bound enzyme
2. Immunoaffinity chromatography
Antibody ligand Protein epitope
+
Matrix Spacer arm
Antibody-bound enzyme
生物大分子
p104
（蛋白质）的制备
概述
在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，
蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的
研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子 结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的 制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的 制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。
5
二. 细胞的破碎
(1)机械法
1) 研磨 2) 组织捣碎器
(2)物理法
1) 2) 3) 4)
1) 2) 3) 4)
反复冻融法 超声波处理法 压榨法 冷热交替法)
自溶法 溶胀法 酶解法 有机溶剂处理法
6
(3)化学与生物化学方法
三、生物大分子的提取
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细 胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶 剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的 过程。
14
1. Ion exchange chromatography
15
Useful rules:
–
At pH > pI, protein net charge is negative
– At pH < pI, protein net charge is positive
– At pH = pI, protein net charge is zero
Vo = void volume Vt = total volume Ve = elution volume
Kav=
Ve-Vo Vt-Vo
use size standards (relative MW) migration also affected by shape
24
25
4. Hydrophobic Interaction Hydromatography (HIC)
物理、化学方法主要有： 比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外 ／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、 以及核磁共振等。
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分 析测定更加快速、简便。
4
生物大分子制备的前处理
一. 生物材料的选择
•天然材料：新鲜，含量丰富，易于提取，价格 便宜。 e.g.钙调素：动物的脑组织，植物花粉 胰蛋白酶抑制剂：大豆种子 溶菌酶：鸡蛋清 抗体：血清 •基因工程产物：对于天然不易得到的蛋白，通 过工程菌或工程细胞表达而获得。
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加
和保持其生物活性。
7
⑴ 用Buffer solution溶液提取：
蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶 液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是 提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生 物大分子应注意的几个主要影响因素是：
1) 盐浓度（即离子强度） 2) pH值 3) 温度 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用 5) 搅拌与氧化
19
3. Gel permeation chromatography (GPC)
Also known as ‘size exclusion chromatography’ and ‘gel filtration chromatography’ Separates molecules on the basis of molecular size Separation is based on the use of a porous matrix. Small molecules penetrate into the matrix more, and their path length of elution is longer. Large molecules appear first, smaller molecules later
2.基本过程： 固相化:将配基以共价键连接于不溶于
水的固相基质上制成固相化吸附剂 (Immobilise)
Baidu Nhomakorabea
配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆 结合的生物专一性物质。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的 物质。 吸附 (Adsorption) 解吸 (Elution )
13
精制(进一步分离)方法(层析法和凝胶电泳)
1. 2. 3. 4. Ion exchange chromatography Molecular sieve chromatography Affinity chromatography(亲和层析) Hydrophobic interactionchromatography （疏水相互作用层析）
16
2.Affinity chromatography
是利用生物大分子之间有专一的亲和力而达到分 离纯化的层析方法
具有专一性亲和力的生物分子对： 酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅酶 因子） 特异性抗原—抗体 激素—受体 DNA—互补的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白
17
1. Substrate analogue affinity chromatography
11
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： ⑴中性盐沉淀（盐析法）： 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 ⑵有机溶剂沉淀： 多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的 分离纯化。 ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）： 多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性 的杂蛋白。 ⑷等电点沉淀： 用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此 法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 ⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇 （Polyethyene glycol）作为沉淀剂。 12
•
separates proteins based on differences in hydrophobicity •absorb proteins to hydrophobic matrix high salt promotes
• hydrophobic
interactions eg, 1 M (NH4)2SO4
5. 双缩脲法
28
六. 蛋白质的纯度鉴定
主要方法： 1. SDS-PAGE 2. PAGE 3. IEF 4. HPLC 5. Analysis of N-terminal AA 6. Other methods
29
Specific activity(比活)= ？
30
31
32
33
34
35
四、生物大分子的分离纯化
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万
种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适
合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关 键部分的基本手段是相同的。
为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和
借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和
技术有：
沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀 等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层
26
5. HPLC (High Performance Liquid
Chromatography )
ADSORBENT PARTICLE
五 蛋白质含量的分析
1. 紫外法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸 收。 2. Lowry法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合 物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸－磷钨酸试剂产 生蓝色。 3. Bradford法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量。 4. 凯氏定氮法
20
21
Large protein Small protein
Applications: 1. purification 2. desalting 3. size determination
Short path length
Longer path length
22
23
Calculating Size
8
⑵ 有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧 链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、 或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正 丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶， 同时具有亲水性和亲脂性。 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶 于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这 种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防 止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效 果的作用。 9
然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细
致而困难的工作。
2
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行
①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行R & D、还是
要发现新的物质。 ②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关 键。 ③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物
理化学性质。
④生物材料的破碎和预处理。 ⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，根据起用途
建立相应的方法。 ⑦产物的浓缩，干燥和保存。
3
分析测定的方法
(即生物学和物理、化学方法)
生物学的测定法主要有：
酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、 免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；
析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制
备电泳等。
10
初步分离方法(沉淀法)
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅 用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时 最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入 固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不 同而达到分离的目的.
Affinity ligand Enzyme
+
Matrix Spacer arm
Active-site-bound enzyme
2. Immunoaffinity chromatography
Antibody ligand Protein epitope
+
Matrix Spacer arm
Antibody-bound enzyme
生物大分子
p104
（蛋白质）的制备
概述
在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，
蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的
研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子 结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的 制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的 制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。
5
二. 细胞的破碎
(1)机械法
1) 研磨 2) 组织捣碎器
(2)物理法
1) 2) 3) 4)
1) 2) 3) 4)
反复冻融法 超声波处理法 压榨法 冷热交替法)
自溶法 溶胀法 酶解法 有机溶剂处理法
6
(3)化学与生物化学方法
三、生物大分子的提取
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细 胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶 剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的 过程。
14
1. Ion exchange chromatography
15
Useful rules:
–
At pH > pI, protein net charge is negative
– At pH < pI, protein net charge is positive
– At pH = pI, protein net charge is zero
Vo = void volume Vt = total volume Ve = elution volume
Kav=
Ve-Vo Vt-Vo
use size standards (relative MW) migration also affected by shape
24
25
4. Hydrophobic Interaction Hydromatography (HIC)
物理、化学方法主要有： 比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外 ／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、 以及核磁共振等。
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分 析测定更加快速、简便。
4
生物大分子制备的前处理
一. 生物材料的选择
•天然材料：新鲜，含量丰富，易于提取，价格 便宜。 e.g.钙调素：动物的脑组织，植物花粉 胰蛋白酶抑制剂：大豆种子 溶菌酶：鸡蛋清 抗体：血清 •基因工程产物：对于天然不易得到的蛋白，通 过工程菌或工程细胞表达而获得。
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加
和保持其生物活性。
7
⑴ 用Buffer solution溶液提取：
蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶 液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是 提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生 物大分子应注意的几个主要影响因素是：
1) 盐浓度（即离子强度） 2) pH值 3) 温度 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用 5) 搅拌与氧化
19
3. Gel permeation chromatography (GPC)
Also known as ‘size exclusion chromatography’ and ‘gel filtration chromatography’ Separates molecules on the basis of molecular size Separation is based on the use of a porous matrix. Small molecules penetrate into the matrix more, and their path length of elution is longer. Large molecules appear first, smaller molecules later