生物大分子制备
生物大分子的分离与制备(共89张PPT)
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生物分子的结构与功能分析：
1. 蛋白质结构分析
2. 酶活力检测
3. 蛋白质组学分析
4. DNA序列分析
5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交
7. 基因克隆8. 基因组构建9. cDNA构建
10. 筛选11. 报告基因检测12. 基因芯片
13. 基因敲除
➢ 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋 白质的合成。
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生物化学分离方法与一般的化学分离方法相比，有下列
几个特点： • 生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化
合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢 变化，如蛋白质和核酸的水解。
有些化合物的含量极微，如激素等。 许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变 变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。
• 功能或分子生物化学阶段（1950 年至今）。研究生命的本质和奥秘： 运动、神经、内分泌、生长、发育、繁殖等的分子机理 。
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生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究的方法：
– 观察：生命现象
– 分离：未知蛋白组分，新基因片段，新的次生代谢物。 （抽提、过 滤、离心、色谱）
立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之 间相互聚集并从溶液中析出。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。
脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热 （50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后 凝聚成油块而被除去。
生命大分子物质的制备
例如： 测定某一蛋白质溶液的浓度
方法：蛋白质与相关试剂（如双缩脲试剂 ） 作用后产生特定颜色的物质（紫色络合物）， 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正 比 ，于波长540nm处进行比色测定。
最后与标准品比对即可计算出该待测蛋白质 溶液的浓度
2.吸咐法:
通过吸咐剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。
在自然科学，尤其是生命科学高度发展的 今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构 与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而 生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决 生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯 度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功 能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离 纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。
⑷许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。
⑸生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物，方法的通用性较差。
生物大分子制备的一般过程：
①根据要制备的生物大分子的目的和要求，选择和 处理合适的材料。
②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物 大分子的关键。
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使 分析测定更加快速、简便。
1、光谱法
所需的样品量少、操作简单、反应迅速、灵敏广泛用于物 质的含量测定
①吸收光谱法：
使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。
方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的 溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以 波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波 长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。
•为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极 性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低；增 加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或 (NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。
生物大分子的定量和化学合成
生物大分子的定量和化学合成生物大分子是指生命体系中的高分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖等。
定量和化学合成是研究这些大分子的重要方法，在生命科学研究领域具有重要地位。
一、生物大分子的定量生物大分子的定量是指对它们的质量、浓度、纯度等进行准确的测量。
在研究生物大分子的功能、结构以及代谢过程等方面，定量分析是不可或缺的手段。
1.蛋白质的定量蛋白质是生命体系中最基本的分子，其定量具有广泛的应用价值。
传统的蛋白质定量方法包括分光光度法、生物素标记法、放射免疫测定法等。
但这些方法均存在一定的局限性，如样品特异性、检测灵敏度、稳定性等问题。
随着生命科学技术的不断发展，新型的蛋白质定量方法也不断涌现。
其中代表性的方法包括蛋白质计数法、薄层扫描法、荧光无标记法等。
这些方法具有高灵敏度、无特异性限制等优点，已成为蛋白质定量领域的热门研究方向。
2.核酸的定量核酸是生命体系中的重要基础分子，其定量在遗传学、生殖医学、病原学等领域具有广泛的应用价值。
目前常用的核酸定量方法包括分光光度法、荧光法、浓度标准曲线法等。
与蛋白质定量不同，核酸的定量方法相对较单一，因此在应用过程中需要特别注意其限制和误差。
例如，核酸浓度过高或过低均会对检测结果产生影响，同时不同的纯化方法和扩增方法也会引起测定结果的偏离。
二、生物大分子的化学合成生物大分子的化学合成是指利用化学手段对生物大分子进行人工合成，以获取大分子的新品种、新结构或增强其活性。
化学合成作为一种重要的生物大分子研究手段，在生物医学、生物化学等领域得到广泛应用。
1.蛋白质的化学合成蛋白质化学合成是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
目前已经成功合成了多种具有特殊结构和功能的人工蛋白质，如改良的酪蛋白、抗体片段等。
重要的蛋白质化学合成方法包括原位合成法、片段合成法、生物发酵法等。
蛋白质化学合成在药物开发和制备领域具有重要的应用前景。
通过人工合成可获得大量蛋白质片段，从而研究其生物功能和结构，解析蛋白质的生理机制，为新药物的研发提供重要支持。
生物大分子的高通量制备与筛选技术研究
生物大分子的高通量制备与筛选技术研究近年来，生物大分子成为了生物医药领域研究热点，尤其是蛋白质、抗体等高分子化合物。
这些生物大分子可以用于疾病的诊断、预防和治疗，在药物研发、生物技术等领域有非常广泛的应用。
但是，这些生物大分子的制备和筛选是非常复杂和繁琐的，因此需要高通量的技术手段来加速和优化这一过程。
一、生物大分子的高通量制备技术生物大分子的高通量制备技术是指通过多种手段实现对大分子的高速、高效制备，以满足其研究和应用需求。
其中，高通量制备技术主要分为三种类型：胞外制备、细胞内制备和全细胞制备。
1. 胞外制备胞外制备通常是通过大量的生物反应体系，如培养基、培养基中添加的辅助剂等，在胞外生产生物大分子，然后进行采集。
这种制备技术可以大量生产生物大分子，但同时也需要大量的胞外环境和辅助剂，存在成本高、步骤繁琐等问题。
2. 细胞内制备细胞内制备则是将表达目标大分子的DNA转化到宿主细胞内，这些宿主细胞可以是细菌、真核生物等，然后利用细胞内的生命活动表达目标大分子，最终通过细胞裂解等方式提取生物大分子。
这种方法可以大量制备同一目标大分子，但同时也存在表达水平不高、纯度过低等问题。
3. 全细胞制备全细胞制备则是将含有表达目标大分子的DNA的载体注入到宿主细胞内，并使其在细胞内表达，最终通过裂解、纯化等步骤提取生物大分子。
这种方法既可以保证表达水平，也可以提供更完整的生物大分子，但繁琐度仍较高。
二、生物大分子的高通量筛选技术生物大分子的高通量筛选技术是指通过多种手段快速并准确地对大分子进行筛选，以寻找出对特定功能或靶标有特异性的生物大分子。
1. 直接测量技术直接测量技术包括阶段性提取技术和流式细胞术技术等，能够直接测量生物大分子的活性和特性，但由于所需时间和费力，无法高效筛选大分子。
2. 抗体对筛选技术抗体对筛选技术主要是基于生物大分子作为抗原与特异抗体的结合特异性，通过该特异性反应来识别生物大分子。
随着抗体库的增大，抗体对筛选技术逐渐成为常用的高通量筛选技术。
生物大分子材料的构筑与应用
生物大分子材料的构筑与应用生物大分子材料是指由生物大分子（如蛋白质、核酸、多糖）构成的一类材料。
这种材料不仅具有良好的生物相容性和生物活性，而且还具有一系列独特的物理和化学性质，使得它们在医药、生物科学和材料科学等领域具有广泛的应用前景。
一、生物大分子材料的构筑生物大分子材料的构筑是一个复杂的过程，需要从分子水平逐步组装起来。
具体构筑过程如下：1. 生物大分子的提取首先需要从生物体中提取出具有特定功能的生物大分子，如胶原蛋白、纤维素等。
这个过程需要经过多个步骤进行化学或生物学处理。
2. 大分子的改性为了满足不同应用领域的需求，生物大分子需要进行一定程度的改性。
例如化学修饰或生物修饰，使其具有不同的物理和化学性质。
3. 组装材料接下来将改性后的生物大分子组装成所需的形态，如薄膜、微球、纤维等。
这个过程通常通过物理或化学方法进行。
4. 材料的后处理最后还需要对组装好的生物大分子材料进行后处理，以确保其在应用中的稳定性和生物相容性。
例如消毒、固化等。
二、生物大分子材料的应用生物大分子材料在生物医学、生物工程、食品科学和材料科学等领域都有广泛的应用。
一些具体应用如下：1. 生物医学领域生物大分子材料在生物医学领域应用最为广泛。
例如，胶原蛋白和明胶可以用于伤口愈合和软组织修复等，因为它们具有良好的生物相容性和生物活性；纤维素和壳聚糖等材料可以用于药物传递、组织工程等领域，因为它们具有良好的可控性和生物相容性。
2. 生物工程领域生物大分子材料在生物工程领域也有广泛的应用。
例如，由天然生物大分子构成的基质可以用于细胞培养、培养基等；纳米级的生物大分子材料可以用于裹包住药物、修饰油水界面等。
3. 食品科学领域近年来，随着人们对健康食品的需求增加，生物大分子材料在食品科学领域的应用也越来越广泛。
例如，生物大分子材料可以用于缓释能量、改善食品质感、保护食品营养成分等等。
4. 材料科学领域生物大分子材料在材料科学领域也有着独特的应用。
生物大分子的制备公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件
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血浆蛋白质分段盐析
硫酸铵饱和度g . (100ml H2O )-1
20 48－33 40－46
> 50
沉淀蛋白质
纤维蛋白 r 球蛋白 a 球蛋白 清蛋白
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而在所有这些办法应用中必须注意保留生物大 分子完整性，预防酸、碱、高温及猛烈机械作用而 造成所提物质生物活性丧失。 生物大分子制备普通分为下列四个阶段：
①选择材料和预处理； ②细胞破碎及细胞器分离； ③提取和纯化； ④浓缩干燥和保留。
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第一节 选择材料及预处理
选材：微生物、植物和动物都可作为制备生物大 分子原材料，所选取材料主要依据试验目的来确 定。 （一）微生物
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2.玻璃匀浆器匀浆 此法对细胞破碎程度比高速组织捣碎机为 高，合用量少动物内脏组织。
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3.重复冻融法 将细胞在－20℃下列冰冻，室温融解，重 复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液 盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
4.化学处理法 有些动物细胞，如：肿瘤细胞可采用十二
烷基硫酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等使细胞 膜破坏。假如细胞壁较厚，可采用溶菌酶处 理效果更加好。
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实 验 碱性磷酸酶分离与纯化 磷酸苯二钠法
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酶分离和纯化
① 基本原则：提取过程中避免酶变性而失去 活性
② 目的：一是把酶制剂从很大体积浓缩到比 较小体积；二是把酶制剂中大量杂质蛋白 和其它大分子物质分离出去。
③ 衡量指标：总活力回收；二是比活力提升
倍数。
表示提纯过程中酶 损失情况
生物大分子的合成及其应用研究
生物大分子的合成及其应用研究随着生物技术的快速发展，生物大分子已成为生物医学、食品、医药等众多领域的重要研究对象。
从基本的多肽、蛋白质、核酸到复杂的糖类、多糖、脂类等生物大分子的制备和应用，已经逐渐成为生物医学研究的关键技术之一。
一、生物大分子的合成方法1.多肽的化学合成方法多肽的化学合成方法主要是采用固相合成法。
这种方法将氨基酸单元逐步地添加到具有反应性的固相小珠子上，然后逐渐合成出目标多肽。
这种方法的好处是可以控制合成速度、减少副反应，结果能够得到高纯度的产物，但是合成时间长且成本高，非常依赖各种非常规的化学试剂。
2.蛋白质表达法蛋白质表达法主要是利用原核或真核细胞的转化方式将DNA基因导入细胞来实现目标蛋白质的产生。
这种方法的优点是能够得到较高产量、成本较低的蛋白质，但是需要对蛋白质表达率、纯度和活性的控制有很高的要求。
3.核酸合成方法核酸合成主要是通过化学方法或生物技术方法来实现。
化学合成主要是利用固相合成法，具有高精度、高效率、高纯度等优点。
而生物技术方法则是直接将目标序列与合成的DNA片段重组得到产物。
二、生物大分子的应用研究1.新型疫苗研究生物大分子作为疫苗制作的重要组成部分，在强烈刺激人体免疫系统的过程中会产生抗体，用于预防和治疗各种疾病。
比如说，糖肽类蛋白的多糖疫苗研究在目前的生物制药领域占据了很重要的地位。
2.肿瘤治疗研究在肿瘤治疗方面，基于蛋白质的免疫治疗已有广泛的研究应用。
目前市场上的治疗药物以及正在研究的候选药物，大部分都是基于活性蛋白或抗体进行治疗。
3.食品领域应用研究食品领域是生物大分子应用的另一个重要领域。
其产品种类繁多，包括面包、奶粉、豆浆、蛋白食品、饮料等等，而研究中发现，某些添加剂具有作用于人体组织蛋白质酶的功效，从而对人体的新陈代谢起到调节作用。
4.化妆品研究在化妆品领域，许多高科技成分都源自于生物大分子。
生物大分子在化妆品中的应用包括修复肌肤、保湿、抗氧化等方面。
生物大分子的合成及应用
生物大分子的合成及应用生物大分子是指生物体中分子量较大的有机化合物，主要包括蛋白质、核酸和多糖等。
它们在生物体内发挥着极其重要的生理功能，是维持生命活动的基石。
本文将从生物大分子的合成及应用两个方面着手，介绍其在生物学、医学、生物工程等领域的广泛应用。
一、生物大分子的合成1. 蛋白质的合成蛋白质是生物体中最为复杂、功能最为多样的大分子，其合成是通过翻译过程来实现的。
具体来说，mRNA将遗传信息传递到核糖体，而tRNA则通过配对作用将氨基酸带到核糖体上，最终形成多肽链。
这一过程中，需要多种酶的参与，如RNA聚合酶、氨基酸激酶和核苷酸递降酶等。
2. 核酸的合成核酸是DNA和RNA两种聚合物的总称，它们在生物体内起着传递遗传信息、维持细胞稳定等重要作用。
核酸的合成是通过DNA复制和转录两种过程实现的。
DNA复制是指将DNA分子中的遗传信息复制到另一条DNA分子中，而转录是指将DNA中的信息转录成RNA分子。
这一过程中也需要多种酶的参与，如DNA聚合酶、RNA聚合酶和去氧核糖核酸递降酶等。
3. 多糖的合成多糖是指由多个单糖分子通过糖基键连接而成的聚糖，包括淀粉、纤维素和半乳糖等。
它们在生物体内起着能量贮存、细胞壁结构稳定等重要作用。
多糖的合成是通过多种酶的参与来实现的，如磷酸糖异构酶、磷酸糖转移酶和醛酮酸还原酶等。
二、生物大分子的应用1. 生物学领域生物学领域中，生物大分子广泛应用于基因工程、遗传学研究、药理学研究等方面。
例如，通过利用蛋白质合成的原理可实现蛋白质的大规模表达和纯化，进而研究其生理功能和应用价值；利用核酸和酶的特异性和灵敏性，可实现基因检测、药物靶标筛选等多种技术手段。
2. 医学领域医学领域中，生物大分子有着广泛的应用前景。
例如，利用蛋白质分子的特异性结合性质，可实现蛋白质制剂的开发和制备、抗体检测技术的发展等；利用核酸分子的结构多样性和生物递进性，可实现基因治疗、DNA疫苗的开发、RNA干扰等技术手段。
生物大分子药物的关键技术研究与应用
生物大分子药物的关键技术研究与应用一、生物大分子药物基础生物大分子药物是指由生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质、抗体等）制备的药物，它们具备高度的特异性和生物活性。
由于其分子量较大，因此相对于传统的小分子化学药物，其药代动力学、药效学和药物毒理学特点均具有巨大的差异。
然而，生物大分子药物也因其高度特异性和作用机制等优势而成为近年来制药行业的热点领域之一。
二、生物大分子药物的制备技术生物大分子药物制备的主要过程包括基因表达、纯化、修饰和标记等步骤。
其中，基因表达是生物大分子药物制备的关键环节，该过程涉及到载体构建、细胞培养和蛋白质表达等技术。
1. 载体构建技术载体构建技术是利用重组DNA技术把感兴趣的外源基因插入到载体DNA中形成重组DNA，进而将其转化到宿主细胞中用来表达蛋白质。
常用的载体类型包括质粒、病毒和细胞质基因组等。
其中，质粒是最常用的载体类型，其结构简单、表达稳定性高、易于扩大生产规模等优点，已经成为生物大分子制备过程中不可或缺的工具。
2. 细胞培养技术在基因表达技术中，细胞培养技术是至关重要的一环。
细胞培养技术将质粒载体插入到宿主细胞中，从而实现蛋白质的高效表达。
通常情况下，细胞培养技术需要考虑适宜的细胞株、培养条件和质粒转染等因素。
3. 蛋白质表达技术蛋白质表达技术是生物大分子药物制备中最核心的技术之一，其主要目的是从重组细胞培养液或组织中获取高纯度的目标蛋白质。
根据蛋白质的特性和用途的不同，通常选择不同的表达系统如细胞表达系统和体外表达系统等。
三、生物大分子药物的药代动力学、药效学和毒理学特征1. 药代动力学特征生物大分子药物的药代动力学特征主要体现在吸收代谢、分布、代谢和排泄四个方面：①生物大分子药物吸收代谢方面主要受到肠道和肝脏的代谢作用影响，这会导致生物大分子药物在靶器官中的生物利用度降低。
②生物大分子药物分布特征由于其大分子结构，往往会导致其分布范围狭窄，即只能在特定器官或局部作用；③生物大分子药物代谢方面，由于其大分子结构过于复杂，因此在代谢酶的作用下分解速度较慢。
生物大分子分离提取操作的基本流程
生物大分子的分离提纯过程可分为以下几个阶段:(1)选择材料。
原则是选取所需成分含量较高、来源丰富、工艺简单、成本低廉的材料。
例如,胰岛素的提取可选择猪胰。
还要注意取材新鲜,要进行预处理,对于蛋白质和核酸的提取要在低温条件下进行,防止生物大分子的变性、失活等。
(2)细胞破碎。
生物大分子绝大部分存在于细胞内。
根据材料来源及实验要求,可选取匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波破碎、自溶、酶消化、表面活性剂处理法等。
(3)亚细胞器的分离。
各类生物大分子在细胞内分布往往是区域化的。
例如DNA几乎全部在细胞核中,电子传递链和氧化磷酸化酶系分布在线粒体,蛋白质合成酶系在内质网(微粒体)上,Na -K -ATP酶分布在细胞膜上等,因此细胞破碎后,可以先分离亚细胞器,这有助于制备纯度更高的生物大分子。
亚细胞器的分离,一般采用不同密度梯度介质,经差速离心法制备。
(4)提取。
提取过程,首先要使生物大分子与其他物质分离开来,使大分子物质充分释放出来,在此过程中,特别要考虑溶剂性质、pH 值、离子强度、介电常数、抽提温度等多种影响溶解度的因素,然后可结合经验并根据具体实验条件灵活地选取某一试剂进行提取。
(5)分离纯化。
刚提取得到的大分子物质,往往是粗制品,含有许多杂质,必须进一步分离纯化。
分离提纯各种生物大分子,主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异,选用有机溶剂沉淀、等电点沉淀、盐析、层析、电泳、超离心、吸附、结晶等方法。
(6)浓缩、干燥及保存。
经过分离、纯化得到的提取液有时很稀,体积较大,需要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法等,去除水分而浓缩。
最后低温保存,有时还需加入防腐剂或稳定剂,防止生物大分子变性失活。
根据材料来源及实验要求,可选取匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波破碎、自溶、酶消化、表面活性剂处理法等。
(3)亚细胞器的分离。
各类生物大分子在细胞内分布往往是区域化的。
例如DNA几乎全部在细胞核中,电子传递链和氧化磷酸化酶系分布在线粒体,蛋白质合成酶系在内质网(微粒体)上,Na -K -ATP酶分布在细胞膜上等,因此细胞破碎后,可以先分离亚细胞器,这有助于制备纯度更高的生物大分子。
化学中的生物大分子的合成与应用
化学中的生物大分子的合成与应用化学作为一门自然科学，拥有着丰富的研究对象和应用场景。
其中，生物大分子的合成和应用是化学领域中的一个重要方向。
生物大分子是指生命体中具有高分子结构和生物活性的大分子化合物，包括蛋白质、核酸、多糖等。
这些大分子在生命体中起着重要的生物学功能，也是生命体与环境相互作用的重要媒介。
在化学中，对于生物大分子的合成与应用的研究，具有重要的理论价值和实际应用价值。
一、生物大分子的合成生物大分子的合成是指通过化学反应的方式，将原料转化为生物大分子的过程。
在生物大分子的合成中，主要应用的是聚合反应和化学修饰反应。
1.聚合反应聚合反应是指通过分子间化学键的形成，将单体转化为高分子的过程。
在生物大分子的合成中，聚合反应是最常用的方法，其中蛋白质、核酸和多糖的合成主要应用的是生物聚合作用。
生物聚合作用是指通过酶的催化作用，将氨基酸、核苷酸和糖分子的单体转化为相应的高分子，即蛋白质、核酸和多糖。
在生物聚合作用中，酶催化反应具有高效、特异性和复杂的调控机制，可以实现高质量和高纯度的生物大分子制备。
2.化学修饰反应化学修饰反应是指通过化学反应引入官能团，改变生物大分子的化学性质和物理性质。
在生物大分子的合成中，化学修饰反应主要应用于生物大分子的分子加工和功能修饰，包括蛋白质的磷酸化、糖化、乙酰化等修饰反应，以及核酸的修饰反应。
化学修饰反应可以带来生物大分子的新功能和更广泛的应用范围，例如，通过对蛋白质的化学修饰，可以改善蛋白质的稳定性、药物代谢性和生物分布性，从而实现药物半衰期延长、毒副作用减少等效果。
二、生物大分子的应用生物大分子是一类重要的高分子化合物，在医药、食品、农业、环境和能源等领域都有着广泛的应用。
1.医药应用蛋白质和核酸是生物大分子中的两种主要类别，在医药领域中应用较为广泛。
蛋白质类药物具有高度的特异性和生物活性，可用于治疗诸如癌症、糖尿病、心血管疾病等严重疾病。
核酸类药物则具有高度的基因特异性和高效的遗传信息传递能力，可用于治疗某些遗传性疾病、感染性疾病等。
生物大分子聚合物的合成与应用
生物大分子聚合物的合成与应用现代生命科学领域中的许多重要研究对象，如蛋白质、核酸、多糖等，都是由大分子聚合物构成的。
生物大分子聚合物的合成和应用是生命科学研究的重要方向之一。
本文将着重介绍生物大分子聚合物的合成方法和在生命科学领域中的应用。
一、生物大分子聚合物的合成方法1. 蛋白质的合成蛋白质是生物体内最重要、最复杂的分子之一。
蛋白质合成的方法包括化学合成和生物合成两种。
化学合成：化学合成方法是指通过人工合成合成具有特定序列和结构的多肽链，从而合成蛋白质。
这种方法的优点在于可以获取大量的蛋白质，缺点是产率低，成本高，而且由于精细的操作需要，常规的化学合成方法难以合成大分子蛋白质。
生物合成：生物合成是指利用生物学技术在活体内合成蛋白质，这是一种更加自然和可行的方法。
在生物体内，蛋白质的合成是由核糖体在翻译时逐个加入氨基酸来实现的。
利用这种方法可以制备大量自然或人工定制的蛋白质，例如蛋白突变体、分泌蛋白等。
2. 核酸的合成核酸是构成遗传信息的基本分子，包括DNA和RNA。
核酸合成也可以采用化学合成和生物合成两种方法。
化学合成：核酸的化学合成方法主要是采用磷酸二酯的化学合成方法，以及酶催化的Phosphoramidite法。
这些方法可以合成足够长度的DNA和RNA分子，成本和产量都比较高。
生物合成：生物合成是指利用DNA合成技术在细胞内合成DNA和RNA分子。
利用基因工程技术可以合成人工定制的DNA或RNA序列，并将其置于细胞中进行表达。
3. 多糖的合成多糖是广泛存在于生物体内的一类大分子聚合物。
多糖可以通过生物合成和化学合成两种方法获得。
化学合成：多糖的化学合成方法一般采用分别使用氧化还原法和酶法。
在环境适宜的情况下，多糖可以通过酶催化反应得到。
生物合成：多糖的生物合成利用细胞合成路径来得到。
细胞内的酶可以将单糖分子转化成多糖链，形成多糖。
二、生物大分子聚合物的应用1. 医药领域生物大分子聚合物在医药领域中被广泛应用。
第一章 生物大分子的制备.
晚期分离纯化
选用精确、费时、需样量少的方法 可选用的方法：吸附层析、盐析、凝胶
过滤、离子交换层析、亲和层析、等电 聚焦 、制备HPLC等
晚期分离纯化要注意的问题：
1.盐析后要及时脱盐。 2.用凝胶过滤时缩小上样体积； 3.必要时可以重复使用同一种分离纯化方法。 4.分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，
细胞的破碎
脂溶性的溶剂或表面活性剂：可以把细胞 壁和膜的部分结构溶解，使细胞释放出内 容物。
可以与研磨法联合使用。
三、抽提
含义：利用适当的溶剂和方法，从原料中 把有效成分分离出来的过程。也就是利用 一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混 合物中分离出一种或几种组分的过程。
抽提液可分为两种：
2、材料的预处理
动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分， 如不马上抽提纯化要在短时间内低温储藏。。 植物：叶片洗净即可或１０h内低温（-4℃-30℃） 储藏；种子需浸泡粉碎；带壳的要先去壳；含油 料多时要进行脱脂处理。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开，经不同 处理。 如暂不提取，菌体最好制成冰冻干粉保存，发酵 液低温短时保存。
五、纯品的鉴定
纯品的鉴定--- 有效成分纯度和性质的分析 包括：纯度鉴定、性质与功能鉴定，结构鉴
定等
五、纯品的鉴定
1、均一性（纯度）：必须采用2～3种不同的纯度鉴定法
（1）电泳法：电泳图谱一条带 （2）沉降分析法（离心）：一条带 （3）紫外吸收法：
纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260» 1.8 纯核酸的光吸收比值： DNA：A260/ A280 » 1.8
抽提有效成分的影响因子
溶剂的极性和离子强度： 降低极性：甘油或蔗糖；提高离子强度：加入
生物大分子的合成及应用
生物大分子的合成及应用生物大分子是指在生物体内合成的具有巨大分子量的有机化合物，包括蛋白质、核酸和多糖等。
这些生物大分子在细胞中发挥着重要的生理功能，同时也具有广泛的应用价值。
本文将探讨生物大分子的合成过程以及它们在医药、食品、能源等领域的应用。
一、生物大分子的合成生物大分子的合成过程主要发生在细胞内，依赖于细胞内的核酸和蛋白质合成机制。
核酸是生物大分子中的重要成分，包括DNA和RNA。
DNA是遗传信息的载体，能够储存和传递生物体的遗传信息。
RNA则在蛋白质合成中起到重要的媒介作用。
在细胞内，DNA通过转录过程合成RNA，然后RNA通过翻译过程合成蛋白质。
这一过程涉及到多个酶的参与，包括RNA聚合酶、核糖体等。
通过这些酶的作用，生物体能够合成出各种功能不同的蛋白质，从而实现多种生理功能。
除了核酸和蛋白质，多糖也是生物大分子的重要组成部分。
多糖是由多个糖分子通过糖苷键连接而成，包括淀粉、纤维素、壳聚糖等。
多糖在生物体内起到能量储存和结构支持的作用。
通过不同的酶的作用，生物体能够合成出具有不同结构和功能的多糖。
二、生物大分子的应用生物大分子在医药领域具有广泛的应用价值。
蛋白质是药物研发中的重要目标，通过合成特定的蛋白质，可以用于治疗各种疾病。
例如，通过合成抗体蛋白质，可以用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。
此外，通过合成特定的核酸序列，可以用于基因治疗，修复患者体内的基因缺陷。
在食品领域，生物大分子也有着重要的应用。
例如，通过合成特定的多糖，可以制备出具有特殊功能的食品添加剂，如增稠剂、乳化剂等。
此外，通过合成特定的蛋白质，可以制备出具有特殊功能的食品，如富含蛋白质的食品、低脂肪食品等。
生物大分子在能源领域也有着潜在的应用价值。
例如，通过合成特定的蛋白质，可以制备出具有高效催化性能的生物燃料电池。
此外，通过合成特定的多糖，可以制备出具有高效能量储存能力的生物材料。
总结起来，生物大分子的合成过程依赖于细胞内的核酸和蛋白质合成机制。
生物大分子制备
生物大分子的制备1概括生物大分子主假如指蛋白质、酶（也是一种蛋白质）和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。
在自然科学，特别是生命科学高度发展的今日，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的构造与功能的研究是探究生命神秘的中心课题，而生物大分子构造与功能的研究，一定第一解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，构造与功能的研究就无从谈起。
但是生物大分子的分别纯化与制备是一件十分仔细而困难的工作，有时制备一种高纯度的蛋白质、酶或核酸，要付出长久和艰辛的努力。
与化学产品的分别制备对比较，生物大分子的制备有以下主要特色：⑴生物资料的构成极其复杂，常常包含有数百种以致几千种化合物。
此中很多化合物到现在还是个谜，有待人们研究与开发。
有的生物大分子在分别过程中还在不停的代谢，所以生物大分子的分别纯化方法差异极大，想找到一种适合各样生物大分子分别制备的标准方法是不行能的。
⑵很多生物大分子在生物资猜中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。
分别纯化的步骤众多，流程又长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。
比如由脑垂体组织获得某些激素的开释因子，要用几吨甚至几十吨的生物资料，才能提拿出几毫克的样品。
⑶很多生物大分子一旦走开了生物体内的环境时就极易失活，所以分别过程中如何防备其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。
过酸、过碱、高温、激烈的搅拌、强辐射及自己的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分别纯化时必定要采纳最适合的环境和条件。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各样参数对溶液中各样构成的综合影响，很难正确预计和判断，因此实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较差，个人的实验技术水平易经验对实验结果会有较大的影响。
因为生物大分子的分别和制备是这样的复杂和困难，因此实验方法和流程的设计就一定尽可能多查文件，多参照古人所作的工作，汲取其经验和精髓，探究中的失败和频频是不行防止的，只有拥有不屈不挠的研究精神才能达到预期的目的。
生物大分子的人工合成及应用研究
生物大分子的人工合成及应用研究随着生物技术的不断发展和进步，人们对生物大分子的人工合成和应用研究越来越感兴趣。
生物大分子是具有生物活性和生物特性的大分子物质，它们包括蛋白质、多糖、核酸等。
这些大分子物质在生物学、医学和材料科学等领域具有广泛的应用前景。
本文将从生物大分子的人工合成和应用研究两个方面入手，对它们的研究现状进行探讨。
一、生物大分子的人工合成人工合成生物大分子是指通过化学方法合成具有生物活性和生物特性的大分子物质。
这种方法与天然合成生物大分子的方式不同，它可以通过改变分子结构来调整生物大分子的性质和功能，从而适应不同的应用需求。
目前，人工合成生物大分子的研究主要集中在以下几个方面：1.蛋白质人工合成蛋白质是生物体内最常见的大分子物质之一，它们具有多种生物学功能，包括酶催化、结构支撑、信号传递等。
由于蛋白质复杂性高、结构多样性强、合成难度大等特点，目前蛋白质人工合成的研究还处于起步阶段。
不过，随着化学、生物学技术的不断发展，一些研究者已经取得了一些重要的进展。
2.多糖人工合成多糖是一类重要的生物大分子，它们广泛存在于植物和动物体内，并在生物体内发挥功能。
多糖的结构复杂、合成难度大，因此多糖人工合成的研究也相对较困难。
不过，随着合成技术的不断改进，一些研究者已经成功地合成了一些天然多糖的模拟物，这些模拟物可以用于制备医用材料或者生物传感器。
3.核酸人工合成核酸是生物体内另外一类重要的大分子物质，它们携带着生物个体的遗传信息。
人工合成核酸主要指合成人工核酸分子，其结构与天然核酸分子类似但有所区别。
人工核酸除了具有天然核酸分子的功能外，还可以通过改变其结构和组分来实现一些新的生物学功能。
通过人工合成核酸，人们可以制备出一些具有特定生物学功能的材料，还可以为基因治疗、基因编辑等研究提供支持。
二、生物大分子的应用研究生物大分子的应用研究主要是指将生物大分子应用于生物学、医学和材料科学等领域，以实现特定的功能和目标。
生物大分子的液相色谱分离和制备
生物大分子的液相色谱分离和制备一、引言生物大分子是生物体内重要的组成成分，比如蛋白质、核酸和多糖等。
它们在生物学、医学、药物研发等领域具有重要作用。
然而，由于其复杂的结构和特性，对生物大分子的分离和制备一直是个难题。
液相色谱作为一种有效的分离技术，被广泛应用于生物大分子的研究和制备中。
本文将围绕生物大分子的液相色谱分离和制备展开讨论。
二、生物大分子液相色谱分离技术概述生物大分子的液相色谱分离技术是利用液相作为介质，在适当的色谱柱上，通过生物大分子在固定相和移动相之间的分配作用，实现对生物大分子的分离和纯化。
常见的生物大分子液相色谱分离技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、逆相色谱等。
1. 凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱是一种通过颗粒大小来分离生物大分子的技术。
它利用颗粒大小分布均匀的凝胶填料，使大分子无法进入凝胶内部，从而较小的生物大分子被排斥在凝胶颗粒外部，实现分离。
这种技术对于生物大分子的分离和制备具有重要意义。
2. 离子交换色谱离子交换色谱是利用生物大分子带有的带电基团与固定相上的离子交换基团之间的静电作用来进行分离的技术。
通过改变移动相中的离子浓度和pH值等条件，调节生物大分子与固定相的相互作用力，实现生物大分子的分离。
3. 逆相色谱逆相色谱是利用生物大分子在疏水性固定相表面的亲疏水性差异来进行分离的技术。
通过调节移动相的亲疏水性条件，使生物大分子在固定相上产生疏水作用或亲水作用，从而实现生物大分子的分离和制备。
三、生物大分子液相色谱分离技术在生物医药领域的应用生物大分子液相色谱分离技术在生物医药领域有着广泛的应用，主要体现在药物研发、生物诊断和基因工程等方面。
1. 药物研发在药物研发过程中，需要对生物大分子进行分离和纯化，以获得纯净的药物原料。
液相色谱分离技术能够有效地对生物大分子进行分离和纯化，为药物研发提供了技术支持。
2. 生物诊断生物诊断领域需要对生物大分子进行准确的检测和分析，以实现对疾病的早期诊断和预防。
生物大分子微操作和微结构的制备和操纵
生物大分子微操作和微结构的制备和操纵生物大分子是指分子量高达数十万至百万的生物大分子，例如蛋白质、核酸、多糖等。
这些大分子在生命过程中发挥着非常重要的作用，因此对其进行微操作和微结构的制备和操纵是生物学、医学、材料科学等领域的重要研究方向。
微操作是指运用微米或纳米尺度的装置和技术对大分子进行操纵或研究的过程。
常用的微操作技术有AFM（原子力显微镜）、光学镊子、拉伸力谱等。
AFM是一种通过针尖探测样品表面微观形貌的技术。
其基本原理是在一个弹簧探头与样品表面之间施加加压力，针尖受到力会向上弹起，根据针尖运动的大小和方向反馈给控制器，从而能够快速、准确地得到样品表面形貌。
通过这种技术可以对单个蛋白质或DNA单分子进行精细测量，从而揭示它们的形态和力学特性。
光学镊子是一种通过光学原理实现对微米或纳米尺度样品进行捕捉、操纵和测量的技术。
利用光学光束的反射、折射和干涉等效应，可以实现对样品的纵向、横向和旋转操纵，并通过显微成像系统实时观测样品形态和位置变化。
这种技术在单分子力谱、细胞粘附力学等领域得到了广泛应用。
拉伸力谱是将单个大分子通过微操作技术拉伸并对其承受力度进行测量的技术。
该技术可以在分子水平上研究单个蛋白质或DNA的分子力学特性，如结构变化、稳定性、弹性等。
这种技术可通过微型拉伸仪、光学镊子等装置实现。
微结构制备和操纵则是利用微纳加工技术和微流控技术对生物大分子进行精确控制的方法。
常用的微结构制备技术有光刻、电子束曝光、微流体自组装等。
光刻是一种通过在光敏消解胶上叠加模板光刻图形的过程来制造微纳米级精度器件的方法。
利用该技术可以制造出立体结构、纳米线、膜等微小结构，应用于生物芯片、光控系统、MEMS等领域。
电子束曝光是一种通过用电子束在光阻层上辐照出器件图形的方法制造微纳米器件。
相对于光刻，电子束曝光可以得到更高的分辨率和精度，但成本和时间成本较高。
微流体自组装是一种通过生物大分子的自组装而实现微米尺度结构制备的方法。
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+
Matrix Spacer arm
Active-site-bound enzyme
2. Immunoaffinity chromatography
Antibody ligand Protein epitope
+
Matrix Spacer arm
Antibody-bound enzyme
14
1. Ion exchange chromatography
15
Useful rules:
–
At pH > pI, protein net charge is negative
– At pH < pI, protein net charge is positive
– At pH = pI, protein net charge is zero
20
21
Large protein Small protein
Applications: 1. purification 2. desalting 3. size determination
Short path length
Longer path length
22
23
Calculating Size
生物大分子
p104
（蛋白质）的制备
概述
在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，
蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的
研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子 结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的 制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的 制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。
16
2.Affinity chromatography
是利用生物大分子之间有专一的亲和力而达到分 离纯化的层析方法
具有专一性亲和力的生物分子对： 酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅酶 因子） 特异性抗原—抗体 激素—受体 DNA—互补的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白
17
1. Substrate analogue affinity chromatography
Vo = void volume Vt = total volume Ve = elution volume
Kav=
Ve-Vo Vt-Vo
use size standards (relative MW) migration also affected by shape
24
25
4. Hydrophobic Interaction Hydromatography (HIC)
11
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： ⑴中性盐沉淀（盐析法）： 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 ⑵有机溶剂沉淀： 多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的 分离纯化。 ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）： 多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性 的杂蛋白。 ⑷等电点沉淀： 用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此 法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 ⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇 （Polyethyene glycol）作为沉淀剂。 12
④生物材料的破碎和预处理。 ⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，根据起用途
建立相应的方法。 ⑦产物的浓缩，干燥和保存。
3
分析测定的方法
(即生物学和物理、化学方法)
生物学的测定法主要有：
酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、 免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；
物理、化学方法主要有： 比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外 ／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、 以及核磁共振等。
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分 析测定更加快速、简便。
4
生物大分子制备的前处理
一. 生物材料的选择
•天然材料：新鲜，含量丰富，易于提取，价格 便宜。 e.g.钙调素：动物的脑组织，植物花粉 胰蛋白酶抑制剂：大豆种子 溶菌酶：鸡蛋清 抗体：血清 •基因工程产物：对于天然不易得到的蛋白，通 过工程菌或工程细胞表达而获得。
19
3. Gel permeation chromatography (GPC)
Also known as ‘size exclusion chromatography’ and ‘gel filtration chromatography’ Separates molecules on the basis of molecular size Separation is based on the use of a porous matrix. Small molecules penetrate into the matrix more, and their path length of elution is longer. Large molecules appear first, smaller molecules later
5. 双缩脲法
28
Hale Waihona Puke 六. 蛋白质的纯度鉴定主要方法： 1. SDS-PAGE 2. PAGE 3. IEF 4. HPLC 5. Analysis of N-terminal AA 6. Other methods
29
Specific activity(比活)= ？
30
31
32
33
34
35
8
⑵ 有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧 链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、 或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正 丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶， 同时具有亲水性和亲脂性。 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶 于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这 种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防 止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效 果的作用。 9
四、生物大分子的分离纯化
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万
种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适
合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关 键部分的基本手段是相同的。
为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和
借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和
技术有：
沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀 等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层
26
5. HPLC (High Performance Liquid
Chromatography )
ADSORBENT PARTICLE
五 蛋白质含量的分析
1. 紫外法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸 收。 2. Lowry法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合 物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸－磷钨酸试剂产 生蓝色。 3. Bradford法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量。 4. 凯氏定氮法
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精制(进一步分离)方法(层析法和凝胶电泳)
1. 2. 3. 4. Ion exchange chromatography Molecular sieve chromatography Affinity chromatography(亲和层析) Hydrophobic interactionchromatography （疏水相互作用层析）
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2.基本过程： 固相化:将配基以共价键连接于不溶于
水的固相基质上制成固相化吸附剂 (Immobilise)
配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆 结合的生物专一性物质。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的 物质。 吸附 (Adsorption) 解吸 (Elution )
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加
和保持其生物活性。
7
⑴ 用Buffer solution溶液提取：
蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶 液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是 提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生 物大分子应注意的几个主要影响因素是：
1) 盐浓度（即离子强度） 2) pH值 3) 温度 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用 5) 搅拌与氧化
5
二. 细胞的破碎
(1)机械法
1) 研磨 2) 组织捣碎器
(2)物理法
1) 2) 3) 4)
1) 2) 3) 4)
反复冻融法 超声波处理法 压榨法 冷热交替法)
自溶法 溶胀法 酶解法 有机溶剂处理法
6
(3)化学与生物化学方法
三、生物大分子的提取
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细 胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶 剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的 过程。
•
separates proteins based on differences in hydrophobicity •absorb proteins to hydrophobic matrix high salt promotes
• hydrophobic
interactions eg, 1 M (NH4)2SO4
然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细
致而困难的工作。
2
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行
①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行R & D、还是