纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析

实验四 纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析

一、实验目的

1，了解各环境因素（如：温度、pH 值等）对酶稳定性的影响。 2，了解衡量酶稳定性的指标：半衰期T 1/2。

二、实验原理

酶的稳定性常用半衰期（T 1/2：：一定条件下酶活力丧失50%所需的时间）来衡量。一般来说半衰期越长表明酶在特定条件下的稳定性越好。

溶菌酶的热失活行为可简化为不可逆的一级失活模型 令时间为t 时活性酶的浓度为[E]t , 酶活性为A t ，则有：

根据式（1），以0

ln

t

A A 对处理时间t 作图其斜率即为d k 。进而通过式（2）便可求得半衰期（T 1/2）。 三、实验材料、试剂、仪器

1. 材 料：实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶。

2. 试 剂：0.5 mol/L NaOH 。

3. 仪 器；pH 计、离心管、金属浴

四、实验步骤

1.酸性条件下溶菌酶的稳定性

稀释5倍 75℃

纯化溶菌酶—————→分装离心管（0.5mL/管）———→分别处理0, 10, 20, 40, 60 min 保温 冷却至室温

———————→测酶活 2. 碱性条件下溶菌酶的稳定性

稀释5倍 75℃

纯化溶菌酶—————→调pH 值调至8.0左右—→分装离心管（0.5mL/管）———→分别

保温

冷却至室温

0000

1/2[][][][]exp()ln[]ln[]ln ln ln

.................................(1)ln 2

..................................(2)t

d t

t d t d t d d t

d

d E k E dt

E E k t E E k t A A k t A k t A T k -==-=-=-==

处理0, 10, 20, 40, 60 min———————→测酶活

3. 酶活的测定及计算方法

方法：

玻璃比色杯快速混匀

底物悬浮液2.0mL—————→加入0.05mL酶液————→测A450nm值1min内的变化（15s记录一次）计算：

采用自定义酶活性单位（U）：当前测定条件下，测定体系在450 nm波长下吸光度每分钟下降0.01所需的酶量为1个酶活力单位（U）。酶活力a（U/mL）= △A450nm/ （1.0 min × 0.01 ×酶液体积）。

五、实验结果与分析：

1，观察加热处理中酶液的变化情况（如沉淀的出现）。

加热处理中，本组的酶液用肉眼观察，变化不太明显，浑浊度微微大了一些。

2，以“相对活力”对“加热处理时间”作图。

表1 酸性条件下溶菌酶酶活力

处理组0 10min 20min 40min 60min

0s 0.681 0.632 0.587 0.537 0.551

15s 0.598 0.587 0.516 0.468 0.499

30s 0.543 0.526 0.462 0.419 0.458

45s 0.492 0.454 0.415 0.377 0.42

60s 0.449 0.395 0.375 0.34 0.381

△A450nm0.232 0.237 0.212 0.197 0.17

酶活力（U/mL）464 474 424 394 340

相对活力（%）100 102.15517 91.37931 84.914 73.27586

表2 碱性条件下溶菌酶酶活力

处理组0 10min 20min 40min 60min

0s 0.5870.5680.5890.6420.686

15s 0.4870.480.5050.5620.639

30s 0.4090.4250.4510.5110.599

45s 0.3240.3830.4080.4760.562

60s 0.2580.3440.3680.4440.531

△A450nm0.329 0.224 0.221 0.198 0.155

酶活力（U/mL）658 448 442 396 310

相对活力（%）100 68.0851167.1732560.1823747.11246

图1 酸碱条件处理不同时间的相对酶活变化

3，以0

ln

t

A A 对处理时间t 作图，其斜率即为d k ，进而便可求得半衰期（T 1/2）。,

图2 酸碱条件处理后的斜率图

由图2可看出，两条方程的拟合效果不太理想，相对系数均小于0.95。且酸性条件的斜率k1=0.0055，碱性条件的斜率k2=0.0104，k1

T 1/2（酸）=126.3，T 1/2（碱）=66.65。可得T 1/2（酸）> T 1/2（碱），说明溶菌酶在经过碱处理后，酶活丧失得更快，这与事实是相符的。

4，比较两者酶液热稳定性的差异，并分析环境pH 值条件对酶分子热稳定性影响的原因。

根据表1、2所得数据，做出图1。由图1可以看出：（1）鸡蛋清溶菌酶较稳定。即使在75℃下处理60min ，酸性下仍有73.28%的相对酶活，碱性下也还有47.1%。（2）从两条曲线的趋势可以看出，溶菌酶在酸性条件下更加稳定，处理20~60min 时的相对酶活均较高；碱性条件下，溶菌酶的相对酶活随着时间

的增加而逐渐下降。

pH值条件对酶分子热稳定性影响的原因：在温度不变的前提下，（1）pH过小（过酸）或过大（过碱）都能使酶蛋白变性而失活，使其热稳定性下降。（2）pH的改变能影响酶活性中心基团的解离程度，同时也可以影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化。但应该注意，酶的最适pH不是一个常数，它的大小与底物的种类和浓度、缓冲液的性质和浓度、介质的离子浓度、温度、反应时间有关。

六、注意事项

1. 由于所得纯化酶的活力太高不便于活力的测定分析，故应将实验二所得的纯化酶作适当稀释（本实验约为5倍）后，再进行加热处理试验。

2.在步骤2中，要确保酶液的pH值被调至8.0左右。