实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定

一． 酚标准曲线的绘制
(1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
管号
1
2
3
4
5
6
0.1mg/mL 酚标准溶液/mL
0.0
0.05 0.10 0.20 0.30 0.40
蒸馏水/mL
2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60
37℃水浴5min
碱性溶液/mL
1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10
实验三
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
一、目的要求
（1）通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。 （2）学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
二、实验原理
米氏方程：在温度、pH、酶浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度的关系可表示为： V = —V—m—ax·—[S]— Km+[S]
Km值：数值上等于酶促反应速度为最大反应 速度一半时所对应的底物浓度
即当V=Vmax/2时，Km=[S]
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
Lineweaver - Burk根据米氏方程，推导出如下直线方程式：（双倒数方程）
—1— = —K—m— ·—1— + —1—
V
Vmax [S] Vmax
以不同的底物浓度—1—为横坐标，
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三、试剂与器材
• 材料：血清 • 试剂：0.04mol/L 基质液、0.1mol/L碳酸盐缓冲液、碱性溶液、
0.5％ 铁氰化钾、0.3％ 4-氨基安替比林、酚标准液（0.1mg/mL） • 器材：恒温水浴锅、可见光分光光度计、移液枪
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
四、实验步骤
[S]
以—1—为纵坐标，
V
此直线与横轴相交的负截距为-
—1—，
Km
由此可以正确求得酶的Km值。
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。 酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物， 颜色深浅和酚的含量成正比。 根据吸光度可以从酚标准曲线上查知酚含量，从而计算化学反应速度。
37℃水浴5min
血清/mL
0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
最ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基质浓度（[S]）
2.00 4.00 6.00
8.00 16.00 0.00
37℃保温15min
碱性溶液/mL
1.1
1.1
1.1
1.1
1.1
1.1
0.3% 4-氨基安替比林/mL 1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0.3% 4-氨基安替比林/mL
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0.5% 铁氰化钾/mL
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
(2) 混匀后室温放置15min，于510nm波长处比色测定。
(3) 以酚含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线。
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
二．底物浓度对酶促反应速度的影响
数据处理：
各管测出吸光度值A，以酚标准曲线
查出各管释放酚含量（μg），根据 公式V= —酚—含—量 即可计算出各管反 应速度V15min
TANKS
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
1.0
0.5% 铁氰化钾/mL
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
实验充三分-碱混性匀磷，酸室酶温米放氏置常10数mi的n 测定
(2) 以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定各管吸光度值，记录 数据，根据酚标准曲线查出对应酚含量 (3) 以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管反应速度的倒数1/V作 纵坐标，作图得负截距求出Km值
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五、实验结果与分析
1、标曲数据
管号
1
2
3
4
5
6
酚含量（μg）
吸光度（A）
2、绘制标准曲线
3、反应数据
管号
1
2
3
4
5
6
基质浓度[S] 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00
1/[S]
酚含量
V
1/V
4、作 1/V = Km/ Vmax·（1/[S实]验）三+-1碱/性V磷m酸ax酶直米线氏，常数求的K测m定值
(1) 取6支试管，作好标记，按下表操作。
管号
1
2
3
4
5
6
0.04mol/L 基质液/mL
0.10 0.20
0.30
0.40
0.80
0.0
0.1mol/L碳酸盐缓冲液/mL 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70
蒸馏水/mL
1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20