植物细胞融合的研究进展

姓名：高娟班级：制药101 学号：020*******

植物细胞融合的研究进展

【摘要】概述了原生质体分离和培养的影响因素,介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。

【Abstract】The effect factors of protoplast isolation and culture were summarized and the latest achievements of protoplast culture and fusion, somatic hybrid selection and authentication were introduced as well.

关键词: 细胞融合; 原生质体; 筛选与鉴定

【Key words】:Cytomixis；protoplast；selection and authentication

细胞融合, 也称细胞杂交, 指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程[ 1]。植物细胞融合又可分为体细胞杂交和配子- 体细胞杂交, 前者指不需经过有性过程[ 2], 直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞, 形成愈伤组织, 并再生出植株的过程, 后者是指性细胞原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞, 形成愈伤组织, 并再生出植株的过程[ 3]..自1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后,Nagata 和Takebe1971年首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株，从此出现了原生质体培养技术。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养, 以及植株的再生和鉴定等环节。

1 原生质体的分离和培养

1. 1 起始材料

起始材料的选择及其生理状态对原生质体的制备及其活力有较大的影响。以往大多以叶片为分离原生质体的材料。近年来, 以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式。采用这些材料制备原生质体具有方法简便、产量高、不污染、不易破碎的优点。

1. 2 基因型

同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同, 所以在相同条件下, 不同品种的再生能力不同。基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用,它不仅影响原生质体的产量和活力, 而且还影响植株的再生。因此, 为了提高原生质体培养的成功率, 要采用多品种和适当品种作为原生质体培养的起始材料。

1. 3 培养基

培养基对原生质体培养影响很大，原生质体能否持续生长、分化, 最重要的条件之一是选择合适的培养基。在木本植物原生质体培养中, 常用的培养基有MS,

MT, WPM, 等。

其中氮源研究较多, 氮是叶绿素、维生素和植物激素的组成部分。

培养基中的碳源和渗透压在原生质体培养中起重要作用。渗透压过高, 原生质体会皱缩以至失去活力; 渗透压过低, 原生质体吸水膨胀而破碎,。由于原生质体无细胞壁, 在初培养时培养基应保持较高的渗透压。随着原生体培养时间的延长, 可逐步降低渗透势以提高细胞的耐受力[ 4]。常用的碳源、渗透剂以葡萄糖较好, 可获得较高的植板率, 且对细胞毒害也小[ 5],原生质体培养中的激素以生长素和细胞分裂素为主。不同植物的原生质体培养, 对激素的浓度要求差异很大, 需要生长素和细胞分裂素的适当搭配[ 6,7]。

1. 4 培养方法

原生质体的培养方法分为液体培养、固体培养和固定化原生质体培养几种方式。

1. 5 培养密度

原生质体的接种密度对培养效果影响很大。密度过小, 原生质体内含物外渗而引起褐变或进行一次分裂后即死亡; 密度过高, 造成营养不良, 再生细胞团很小, 而且很快停止生长。在一定范围内, 原生质体具有较强的恢复分裂能力, 一般密度以104～105mL-1为宜[8]。

1. 6 酶制剂

在木本植物中, 原生质体的分离常用的酶为纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶和胼胝质酶。但不同植物所用酶的种类有较大的差别。在原生质体分离时，常常将降解纤维素的酶和分解果胶的酶混合使用。

1. 7 材料的预处理

许多研究者报道, 酶解之前对材料进行预处理有利于原生质体的分离。

2 原生质体融合

2. 1 应用原生质体融合技术产生杂种植株

自Carlson等在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来, 原生质体融合技术在植物中已广泛应用。

2. 2 原生质体融合方法

目前广泛使用的是PEG法和电融合法。

在应用PEG进行融合时,不论是同种细胞融合还是异种细胞融合, PEG浓度愈小, 反应时间愈长, 细胞的融合率愈大；电融合法对细胞没有毒害作用, 操作简便, 融合同步性好，但仪器价格比较昂贵，因此目前仍不如PEG法适用普遍。

配子-体细胞原生质体融合技术主要借鉴了体细胞原生质体的融合方法。性细胞原生质体对融合处理很敏感, 容易与其它原生质体融合[ 9]。但是因为它的形态、密度等多不同于体细胞原生质体, 其融合技术与体细胞杂交有所差异。影响因素主要有融合处理方式、原生质体密度与比率、融合诱导剂的浓度等。性细胞原生质体往往形体小而密度大, 为了提高融合效率, 通常在提高性细胞原生质体密度

的同时, 相对降低后者的密度, 以寻求最佳比例[ 10,11]。

2. 3 原生质体融合的方式

原生质体的融合方式有两种: 对称融合和非对称融合。通过这两种融合方式可产生3种类型的杂种: 对称杂种、非对称杂种和胞质杂种。

3 杂种细胞的筛选和鉴定

3. 1 杂种细胞的筛选

目前主要的筛选方法有3种: ①突变细胞互补选择法：该方法的局限性在于突变体不易获得, 而且有些突变体不易再生, 所以尚未得到广泛应用。②机械选择法：根据愈伤组织的颜色、荧光特性等在显微镜下机械分离杂种细胞。该法不但准确, 而且效率高，但由于仪器价格昂贵, 使用者还很少。③不对称融合法：指一方亲本的全部原生质与另一方亲本的部分核物质及胞质物质重组, 产生不对称杂种[ 12]。一般用碘乙酰胺( IOA) 或碘乙酸( IA)处理受体, 使其细胞失活。据统计, 现在90%以上的体细胞杂交为不对称融合。

一般来说，配子-体细胞杂交产生杂种细胞的筛选方法是: 性细胞原生质体被异硫氰酸荧光素( FITC)或DAPI 预染后, 再与体细胞原生质体融合, 在荧光显微镜下可清楚地完成杂种细胞的鉴定。

3. 2 杂种细胞的鉴定

获得再生植株后, 必须进一步证实杂种的真实性并了解它与亲本间的联系与区别。除了传统的形态学、细胞学及生化方法得到了继续发展外, 近年来基因组DNA的RAPD和AELP分析以及细胞器DNA的Southern杂交分析广泛应用于对称或不对称杂种细胞鉴定[ 13]。

参考文献:

[ 1]王凯基,倪德祥. 植物生物学词典[ M]. 上海: 上海科技教育出版社,1998. [ 2]朱至清. 植物细胞工程[M] . 北京:化学工业出版社, 2003.

[ 3]李昌功. 被子植物配子- 体细胞杂交研究进展与展望[J] . 武汉植物学研究, 1997,15( 3) :269-273.

[ 4] 王哲之, 张苏锋. 陆地棉胚性愈伤组织原生质体的制备、培养及植株再生[J]. 植物报,1998, 40(3): 234-240.

[ 5] 卫志明, 许智宏,许农, 等. 悬铃木叶肉原生质体培养再生植株[J] . 植物学报, 1991,33(33) :813-818.

[ 6] 何业华, 胡芳名,谢碧霞. 枣树原生质体培养及其植株再生[ J]. 中南林学院学报,1999, 19(3):29-31.

[ 7] 刘巧红, 江莉萍,顾红. 甜菜原生质体培养及大块愈伤组织的产生[J]. 中国甜菜糖业,2001, 2: 14-15.

[ 8] 金晓玲, 何平. 木本植物原生质体培养与融合研究进展[J]. 浙江师范大学学报(自然科学版) ,2003,26( 1) :54-59.