农杆菌介导的植物转基因技术实验指导

农杆菌介导的植物转基因技术

一、实验目的

1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。

2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。

二、实验原理

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

实验一培养基配制

一、仪器和试剂

1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台

2、药品：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ，Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar (琼脂) 1.5g/100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。

二、实验方法

第一组配制YEB固体培养基

1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract (牛肉浸膏)；

1.25g Peptone (蛋白胨)；0.25g Yeast extract (酵母提取物)；1.25g Sucrose

(蔗糖)；1g MgSO4.7H2O；琼脂粉3.75g；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml，用NaOH调pH=7.4。

2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100μg/ml kan+50μg/ml Str+50μg/ml rif），以免温度过高导致抗生素失效。

4、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min，等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。

第二组配制YEB液体培养基

1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract (牛肉浸膏)； 2.5g Peptone (蛋白胨)；0.5g Yeast extract (酵母提取物)； 2.5g Sucrose (蔗糖)；2g MgSO4.7H2O；将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。

2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100μg/ml kan+50μg/ml Str+50μg/ml rif），以免温度过高导致抗生素失效。

4、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。

5、分装好后，封口备用。

第三组配制MS液体培养基

1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；

5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml，用NaOH 调pH=5.8。

2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、乙酰丁香酮的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的乙酰丁香酮。

4、分装：将培养基分别分装到三角瓶中，每个三角瓶中倒入40ml，共12个三角瓶。

5、分装好后，封口备用。

第四组配制MS共培养基

1、配制500mlMS固体共培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照实际需要，根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8，然后再加入7%的琼脂粉3.5g。

2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml，共20个平皿。

4、分装好后，封口备用。

第五组配制MS分化筛选培养基

1、配制1000mlMS固体共培养基：用2个500ml三角瓶进行盛取，先在500ml 三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照实际需要，根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8，然后再加入7%的琼脂粉3.5g。

2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、分装：将培养基分别分装到平皿中，每个平皿中倒入25ml，共40个平皿。

4、分装好后，封口备用。

第六组配制MS生根培养基

1、配制500mlMS固体共培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（根据母液浓度计算用量），混匀定容至500ml，用NaOH调pH=5.8，然后再加入7%的琼脂粉3.5g。

2、灭菌：将盛有500ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、分装：将培养基分别分装到100ml三角瓶中，每个三角瓶中倒入35ml，共14个三角瓶。

4、分装好后，封口备用。

实验二植物转化工程菌的制备

一、仪器和试剂

1 仪器：低温离心机（德国EPPENDORF公司）；恒温培养箱（哈东联）；超净工作

台（净化），恒温摇床。

2 试剂：根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens.)菌种EHA105，YEB培养基，

接种环，牙签。

二、实验方法

1、将农杆菌接种于附加50mg/L 卡那霉素、50mg/L 链霉素、50mg/L 利福平的YEB固体培养基上，28℃暗培养48h，至长出单菌落。

2、用接菌环挑取单菌落，接种在含相应抗生素的YEB液体培养基中，于28℃，180rpm，培养过夜。

3、待菌液长至OD600为0.4 ~ 0.6时，将其按1∶10的比例接种到新鲜的上述培养基中振荡培养，进行二次活化。