离心技术与离心机

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离心半径与离心力
最小离心力场 最大离心力场
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35 0
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沉降中的颗粒
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离心与纯化
在离心力场中加速度 达到数万甚至数十万倍 重力加速度时，颗粒的 沉降也加快了同样的倍 数。这就使得许多在重 力场中不能沉降的细小 颗粒及密度较低的物体 组份能用离心技术进行 分离纯化。
5ml血液
D为颗粒的直径
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颗粒沉降速度与三方面的因素
(1)颗粒本身的性质 •沉降速度与颗粒直径和密度成正比。密度相同时大颗粒比小 颗粒沉降快；大小相同时，密度大的颗粒比密度小的沉降快。
(2)介质的性质 •沉降速度与介质的粘度、密度成反比，介质粘度、密度大，则颗
•(3)离粒心沉条降件慢。
•颗粒沉降速度与离心时转速和旋转半径成正比。如果其他的条件不变， 沉降速度随着r的增大而增大。
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3．氯化铯
是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1．91g／ml。由于它是重金属盐类， 在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白 的分离，但价格较贵。
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4．卤化盐类：
KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。 NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。
•f为阻力系数；dx/dt为微粒的运动速度
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沉降速度 微粒等速沉降运动时的速度 m(1-ρ0/ρ)g = f (dx/dt) (dx/dt) = m(1-ρ0/ρ)g/ f 粒子的沉降速度与m(1-ρ0/ρ)成正比，与阻力系数f成反比。
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下沉的速度与微粒的大小、形态、密度、重 力场的强度及液体的黏度有关。
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第一节 离心技术的基本理论 一、离心机的工作原理 二、离心力与相对离心力 三、液体中的微粒在重力场中的分离 四、液体中的微粒在离心力场中的沉降
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第一节 离心技术的基本理论
物质的悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离
心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物
大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而使
溶液得以分离、浓缩和提纯，颗粒的沉降速度
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（三）沉降系数 指单位离心场作用下颗粒沉降的速度 S = v／(ω2r) V=6.092×10-4[D2(ρ-ρm)n2r/ηm] S=K[D2 (ρ-ρm)/ηm]
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沉降系数
S=K[D2 (ρ-ρm)/ηm]
假定颗粒为球形 K=1/18
沉降系数s的值与颗粒的大小、形状和密度，以及离心所使用的介质的密度 和粘度有关。 与转头的速度和类型无关。 各种生物样品的沉降系数差别很大
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离心技术与离心机
centrifugal technique and centrifuge
将含有微小颗粒的悬浮液置于转头中，利用转头绕轴旋转所产 生的离心力，将悬浮的微小颗粒按密度或质量的差异将其分离 的方法。
血浆 试管 离心沉 降物
血液
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教学基本要求
1.掌握常用的离心方法，离心机的分类与结构 2.熟悉离心技术的基础理论，离心机的应用 3.了解离心机的维护、离心方法的进展
密度梯度离心机
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优点 1.分辨率高，分离效果好，可一次获得较纯颗粒； 2.适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒； 3.颗粒不会积压变形，能保持其活性，并可防止已形成的区带由于对流而引起 混合。
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缺点
1.离心时间较长；需要制备成梯度液； 2.操作严格，不宜掌握。
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前言
离心现象 物体在离心力场中表现的沉降运动现象。
离心技术
应用离心沉降进行物质的分 析和分离的技术
离心机 实现离心技术的仪器
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前言
离心技术主要用于各种生物样品的 分离、纯化和制备，在细胞生物学和 分子生物学的每一进程中，总可见到 离心技术的运用。离心机是生命科学 研究的基本设备，在生命科学，特别 是生物化学和分子生物学研究领域， 随着分子生物学研究对分离设备日益 增多的需要而有了很大的发展。
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常用的密度梯度材料 1．蔗糖：
水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1．33g/ml，且由于价 格低，容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度 材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。
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2.聚蔗糖：
商品名Ficoll，常采用Ficoll—400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压 低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用 于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。
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分类
不同的离心分离 的原理
1.速率区带离心法 2.等密度区带离心法
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（一）、速度区带离心
将样品置于一个平缓的介质梯度中沉降 该梯度的最大密度低于样品混合物的最小密度 样品颗粒按照其不同的沉降速率沉降，从而互 相分离。 离心一定时间后不同大小的颗粒将沉降在不同 的层次，产生所谓区带。
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前言
本章将对基础医学、检验医学、临床医学等实验室 中常用于分离和提纯样品的离心技术的基础理论，常用 的离心方法和相关的离心机、专用离心机，离心机的分 类与结构，离心机的使用和维护，离心方法和离心机的 进展等进行简要的介绍。
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主要内容
第一节 离心技术的基础理论 第二节 常用的离心方法 第三节 离心机的分类与结构 第四节 离心机的应用和维护 第五节 离心方法和离心机的进展 本章小结
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梯度材料的选择原则：
1．与被分离的生物材料不发生反应，且易与所 分离的生物材料分开。 2．可达到要求的密度范围，且在所要求的密度 范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化 较小。 3．不会对离心设备发生腐蚀作用。 4．容易纯化，价格便宜或容易回收。 5．浓度便于测定，如具有折光率。
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二、离心力与相对离心力 1.离心力（Fc） 离心运动 物体远离圆心运动的现象 离心运动是由于向心力消失或不足而造成的。
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离心力（Fc）
Fc m 2r m( 2N )2 r 4 2 N 2rm
60
3600
ω2 r ：离心加速度
ω： 旋转角速度 Ｎ： 每分钟转头旋转次数 r ： 为离心半径 m： 质量。
RCFa v：
离心管中点的离心力。
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三、液体中的微粒在离心力场中的沉降
在离心机中，离心 管放于离心转头里， 当离心机开动时，离 心管绕离心转头的轴 旋转，作圆周运动， 在离心管内的样品颗 粒将同样运动。
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（一）离心沉降 在没有介质阻力时，颗粒会沿切线 方向飞去。
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前言
在引入了微处理器控制系统后，各种转速级别的离 心机已经可以分离纯化目前已知的各种生物体组份 （细胞、亚细胞器、病毒、激素、生物大分子等等）。 而对离心方法的深入研究又可以利用这些离心设备更 快、更纯、更多地分离纯化样品。诸如分离出化学反 应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物， 在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、 细胞器及生物大分子物质。
W为重力
若ρ>ρ0 若ρ<ρ0 若ρ=ρ0
F向下，微粒下沉。 F向上，微粒上浮。 F为零，微粒处于平衡悬浮状态。
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重力沉降
液体中的微粒受重力的作用，较重的微粒 下沉与液体分开
微粒在液体介质中的沉降将受到介质的浮力、介质阻 力及扩散现象的影响。
混合液
静置一段时间后
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摩擦阻力Fr
Fr = f (dx/dt)
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二、密度梯度离心法（区带离心法）
样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降 平衡，在离心力作用下把颗粒分配到梯度液中某 些特定位置上，形成不同区带的分离方法
分离前
分离后
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离心时先将样品溶液置于一个由 梯度材料形成的密度梯度液中， 离心后被分离组份以区带层分布 于梯度液中。
• FRC(管口)=1.119×10-5×(12 000)2×4.8×g =7 734×g
• FRC(管底)=1.119×10-5×(12 000)2×8.0×g =12 891×g
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离心力的表示
rpm: 转速 g：
低速离心时 高速离心时
可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。
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缺点
适用于沉降速度差别在一到几个数量级的混合样品的分离 1.分辨率有限、分离效果差，不能一次得到纯颗粒； 2.壁效应严重，容易使颗粒变形、聚集而失活。
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差速离心法
对分离纯度要求较高的样品应用此法，容易 造成被分离物的大量丢失，变性以及造成污染， 尤其对于一些沉降系数相差不太大的组份要获 得完全的分离提纯比较困难，所以该离心方法 常用于要求不严格样本的初步分离和大批量标 本的处理，例如分离已破碎的细胞各组份等。
这种方法适用于分离密度相似而大小有别的 样品。
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由于这种方法是根据颗粒的沉降速率来完成分离，离心后分别处于不同的 密度梯度层内形成几条分开的样品区带且，所以称作速度区带离心。
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梯度液的作用
梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取 样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因 机械振动而引起已分层的粒子再混合，常用 的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。
取决于离心机的转速、颗粒的质量、大小和密
度。
血浆
试管 离心沉降物
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血液
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一、液体中的微粒在重力场中的沉降
阿基米德原理
Fb=Vρ0g=(m/ρ) ρ0g
V为物体的体积，m为物体的质量， ρ为物体的密度，ρ0为介质的密度， g为重力加速度
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使微粒下沉的力:
F= W-Fb = Vρg- Vρ0g = V g(ρ-ρ0) =Βιβλιοθήκη Baidum(1-ρ0/ρ)g
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介质的阻力越大，颗粒的沉 降速度越小、沉降的距离也 越短。旋转速度越大，颗粒 的沉降越快。
离心沉降示意图
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(二） 沉降速度 在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离
d x m ( 1ρ0/ ρ )g
dt
f
ρ0：介质的密度 ρ：微粒的密度
g：重力加速度 f：阻力系数
V=6.092×10-4[D2(ρ-ρm)n2r/ηm]
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原理
在离心后用倾倒 的办法把上清液 与沉淀分开，然 后将上清液加高 转速离心，分离 出第二部分沉淀， 如此往复加高转 速，逐级分离出 所需要的物质。
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优点与缺点 优点
1.操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开; 2. 分离时间短、重复性高； 3.样品处理量大。
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（四）沉降时间(Ts)
样品颗粒完全沉降到管底内壁的时间
•ts=(1/S)[(lnx2-lnx1)/ ω2]
x2：旋转中心到离心管底内壁的距离 x1：旋转中心到样品溶液弯月面之间的距离 S：样品沉降系数
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（五）离心半径与离心力
最大离心半径
最小 离心 半径
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rmin：最小离心半径 rmax：最大离心半径
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2.相对离心力(FRC) 离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数 单位是重力加速度“g”
FRC=(ω2r/g)×g 只要FRC值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。
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• 例如：在某个角度转头中，离心管口到旋转 中心的距离为4.8cm，而离心管底到旋转中 心的距离是8.0cm，当转速为12 000r／min 时，离心管口和离心管底所受到的相对离心 力FRC分别是：
物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。
时间
重
力
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扩散 由于微粒的热运动而产生的质量迁移现象,主要是由于密度差引起的。
颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。
小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它 们在溶液中成胶体或半胶体状态
扩散现象
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扩散与沉降 扩散现象是不利于样品分离的 加大重力，可能克服扩散现象的不利影响 离心机就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，迫使液体中微粒克服 扩散加快沉降速度，把样品中具有不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。
离心5分钟 血细胞
血浆
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第二节 常用的离心方法
一、差速离心法 二、密度梯度离心法
三、分析性超速离心法
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一、差速离心法
分步改变离心速度，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分批沉淀分离 的方法
利用不同的粒子在离心力场中沉降速度的差别
主要用于一般样品的分离及特殊样品的 分离，例如分离细胞器和病毒。