凝聚胺法交叉配血试验

凝聚胺法交叉配血试验操作规程[目的]保证交叉配血试验准确，确保临床输血安全。

[适用范围]XXX医院输血科[职责]具有专业技术的工作人员主要负责XXX医院输血标本的交叉配血试验，但只对该单份标本负责。

[相关文件]试剂采购、保存和使用管理程序设备采购、使用管理程序消毒与清洁管理程序标本采集、运输、保存和报废管理程序紧急用血管理程序[相关记录]仪器设备的采购、使用和维护记录仪器的温度记录恒温水温箱的换水和消毒记录消毒液的配置记录清洁消毒记录试剂采购、使用记录标本交接和报废记录交叉配血记录紧急用血记录[实验原理]红细胞表面带有大量的负电荷，以避免产生自发性聚集，当红细胞悬浮在电解质中时，阳离子会被红细胞的负电荷所吸引，此时红细胞则被扩散的双层离子云所围绕而形成Zeta电位，Zeta电位决定红细胞之间的排斥作用。

凝聚胺技术首先利用低离子溶液（LIM）降低介质的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，以促进红细胞与血清（血浆）中的抗体结合。

其次加入的凝聚胺（Polybrene）溶液是一种高价阳离子多聚物、肝素中和剂，溶解后能产生很多正电荷，可以中和红细胞表面带有的负电荷，使红细胞的Zeta电位降低，缩短红细胞之间的距离，使红细胞产生非特异性的凝集。

最后加入的悬浮液（Resuspending）具有中和凝聚胺（Polybrene）阳离子的作用，使正常的红细胞非特异性凝集散开，试验结果为阴性；但如果红细胞被相应的抗体致敏，则会被凝聚胺凝集而不会散开，试验结果为阳性。

[仪器器械]玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、交叉配血专用离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。

[试剂]生理盐水、凝聚胺试剂、Anti-human IgG血清，均为有合格证件的正品。

[试剂保存和稳定性]1．凝聚胺试剂须保存在2-25℃（其中阴、阳对照血清应储存在2~8℃）。

在适当储存条件下有效期24个月。

2．抗人IgG血清低温冰箱保存。

复溶后放2—4℃冰箱保存。

3．凝聚胺试剂①低离子介质溶液（LIM）：含葡萄糖，乙二胺四醋酸-2钠及稳定剂。

②凝聚胺溶液（Polybrene）：含凝聚胺，氯化钠及稳定剂。

③复悬液（Resuspending）：含柠檬酸钠，葡萄糖及稳定剂。

④阳性对照血清：含抗D血清、氯化钠及稳定剂。

⑤阴性对照血清：含AB血浆、氯化钠及稳定剂，不含红细胞血型抗体。

[标本收集与处理]1、受检者血清：采集受检者静脉血2~3ml，经1000r/min离心1分钟或室温静置1小时后取上清。

2、2~5%的受检者红细胞：采集受检者静脉血或末梢血，先用生理盐水洗涤红细胞33输用时间超过12 小时的，必须重新采集标本。

4、标本出现中度以上溶血者，为不合格标本，不能用于检测。

[实验方法与步骤]1、分别制备受血者和献血者3~5%的红细胞悬液（取2支使管分别标注为受血者管和献血者管，再分别加入2ml生理盐水，在受血者管加入1滴受血者红细胞，在献血者管加入1滴献血者红细胞，混匀后备用）。

2、取4支使管，分别标注主侧、次侧、阴性对照和阳性对照：主侧管：先加入2滴受血者血清（血浆），再加入1滴献血者2~5%红细胞悬液；次侧管：先加入2滴献血者血清（血浆），再加入1滴受血者2~5%红细胞悬液；阴性对照管：先加入2滴阴性对照血清，再加入1滴献血者2~5%红细胞悬液；阳性对照管：先加入2滴阳性对照血清，再加入1滴献血者2~5%红细胞悬液。

3、混匀后各加入LIM溶液0.65ml，轻轻混匀，于室温下静置1分钟。

4、再各加入2滴Polybrene溶液，轻轻混匀，于室温下静置15秒。

5、用交叉配血专用离心机3400 r/min（相当于1000g离心力）离心10秒，然后倒掉上清液（不要沥干），让管底残留约0.1 ml液体。

6、轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做。

重做后仍然没有凝集现象出现，可能试剂失效。

7、最后各加入2滴Resuspending溶液，轻轻摇动试管并同时目测凝集是否散开，再进一步倒在玻片上用显微镜观察凝集是否散开。

如果在60秒内凝集散开，表明是由Polybrene引起的非特异性凝集，配血结果相合；如果凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，配血结果不相合。

如果想进一步检测Anti-K抗体，则必须继续做辅助性的抗球蛋白试验，步骤如下：8、再滴入1滴Resuspending溶液。

供血者ABO血型（正、反定型），并常规检查患者Rh（D）血型，正确无误时可进行交叉配血。

13、结果判断必须先肉眼观察，再进行显微镜观察。

注意观察弱凝集和排除非特异性凝集。

14、交叉配血试验中发现有不配合时，首先应考虑受血者和供血者的ABO血型和Rh(D)血型定型是否错误，必要时进行抗体筛检。

其次，应注意有无特异性同种抗体，特异性未知的同种抗体存在，或者患者的血清在室温37℃或抗球蛋白血清中凝集所有的其他红细胞，造成交叉配血的困难，应进一步作有关试验进行鉴定。

15、两人值班时，交叉配血试验由两人互相核对；一人值班时，操作完毕后自己复核，并填写配血试验结果。

（按“交叉配血核对制度”进行）。

16、各供血者间需进行交叉配血；已经输注的血液不足24 小时的，供血者间也需进行交叉配血。

17、凝聚胺试剂还可用于辅助抗体筛检试验、辅助性抗人球蛋白试验和辅助性血型鉴定。

具体操作方法详见凝聚胺试剂盒使用说明书。

18、判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。

[交叉配血的影响因素及解决方法]准确的交叉配血是临床安全有效输血的最后一条重要保证。

输血配合是选择适合受血者输注的血液，使输血的成分能在受血者体内有效存活，并且无不良反应，即输入的红细胞在受者体内必须不凝集和不溶血，输入的血浆成分不导致受者自身红细胞显著破坏，使受血者恢复健康。

影响交叉配血的因素很多，主要如下：1、标本①血标本的采集错误、稀释和溶血。

另从受检者采集l份新鲜血液标本，这样可以纠正因污染或搞错样本造成的不合。

标本一般要求离体后尽快实验，最长不能超过3天，每次输血后受血者和供血者的血标本应在2～8℃保存7天。

②患者的药物使用有时也对实验有一定影响，当受血者使用肝素治疗时，应使用硫酸鱼精蛋白对抗使标本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等治疗，应注意将红细胞洗涤。

③受检者红细胞上抗原位点过少(如亚型)或抗原性减弱(见于白血病或恶性肿瘤)，以及类B或cisAB等。

●如疑为A抗原或B抗原减弱，则可将受检红细胞与抗—A或抗—B血清做吸收及放散试验，以及用受检者唾液作A、B、H血型物质测定（只对80％HAB分泌型的人有用）。

●如受检者为A型血而疑为有类B抗原时，可用下列方法进行鉴别：(1) 观察细胞与抗—A及抗—B的凝集强度，与抗—A的反应要比与抗—B的反应强，这种区别用玻片法作试验更为明显；(2) 用受检者红细胞与自身血清作试验，血清中的抗—B不凝集自身红细胞上的类B抗原；(3) 检查唾液中是否有A、B物质，如果是分泌型，可检出A物质而无B物质；(4) 核对患者的诊断，类B抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关。

④受检者血清中蛋白紊乱(高球蛋白血症)，或实验时温度过高，常引起红胞呈缗钱状排列。

如试验结果红细胞呈缗钱状排列，加等渗盐水l滴。

混和，往往可使缗钱现象消失。

注意不应先加盐水l滴于受检者血清中而后和红细胞做试验，以免使血清中抗体被稀释。

⑤细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。

如发现多凝集现象，应考虑由遗传产生的Cad抗原活性；被细菌酶激活的T或TK受体；或产生机制不太明了的Tn受体所引起。

多凝集红细胞具有以下特点：(1)能被人和许多家兔的血清凝集；(2)能与大多数成年人的血清凝集，不管有无相应的同种抗体。

(3)不被脐带血清凝集。

(4)通常不与自身的血清凝集。

(5)如有条件可用外源凝集素加以鉴别。

⑥检者血清中缺乏应有的抗-A及或抗—B抗体，如丙种球蛋白缺乏症，老年人血清中抗体水平大幅度下降等。

如果试验结果未见凝集，应将细胞及血清试验至少在室温和4℃放置30min，用显微镜检查核实。

⑦血清中有意外抗体，如自身抗—I，常引起干扰。

用A1、A2、B、O红细胞及自身红细胞检查受检者血清。

如果怀疑是抗—I，用O型(或ABO相合的)脐血红细胞检查。

⑧各种原因引起的红细胞溶解，误判为不凝集。

部分溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体。

将红细胞洗涤数次，配成2~5%生理盐水细胞悬液，用抗—A、抗—B、抗—Al，抗—A十B及抗H做试验可以得到其它有用的信息。

对受检红细胞作直接抗球蛋白试验，如结果呈阳性，表示红细胞已被抗体致敏。

2、试剂①运输、贮存等条件不适可导致试剂变质失效，造成配血错误。

实验前进行试剂外观、效价等项目质量控制。

②不同抗凝剂制备的标准红细胞质量也不同；另外，红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，易误判为阴性反应。

应依据要求正确配制红细胞浓度。

③启用生理盐水时，应及时贴上启用时间；超期的试剂要及时更换。

使用过程中，怀疑试剂污染时或配血结果可疑时，必须更换试剂。

3、冷凝集素在ABO血型鉴定和交叉配血的过程中，冷凝集素是影响ABO血型正反不符和交叉配血不合的常见原因，尤其是在冬天气温较低时，某些病人血清中含有冷凝集素而导致出现假阳性。

正常人血清中冷凝集素效价一般不高，且在4℃以下时才有活性。

但由于人免疫系统的差异，在恶性肿瘤或病原体感染后有时冷反应性自身抗体可异常增高，造成溶血性贫血。

这种冷凝集素效价在4℃可高于1000，用37℃生理盐水洗涤红细胞，操作时再置于37℃水浴中轻轻摇动可以排除冷凝集素的干扰。

4、自身免疫性溶血性贫血红细胞被自身抗体强烈致敏后将干扰ABO定型，且自身抗体的存在会导致交叉配血不合，选择合适的试验方法对红细胞上结合的抗体做放散处理，确定抗体的特异性。

如果抗体属于同种抗体，则交叉配血时应选取该抗原阴性的献血者的血液。

如果该抗体无法确定特异性，则交叉配血时要根据患者自身红细胞与自身血清的对照反应选取较弱反应的献血者血液，因为自身抗体的干扰而发生ABO正反定型不相符时，可用37℃～45℃生理盐水洗涤红细胞三次，或者用放散后的红细胞（放散方法需不破坏红细胞结构），血清定型则可用洗涤或放散后的红细胞将血清中的自身抗体吸收后再进行。

5、弱凝集血型试验是抗原抗体反应，当患者红细胞上抗原异常或血清中存在ABO血型以外的不规则抗体时，可能会导致减弱的或缺少的凝集反应。

抗原异常包括：①亚型，这种亚型红细胞抗原性较弱，可以通过亚型定型试剂来具体定型。

②红细胞抗原形成不足或敏感性降低，如新生儿、老年人及少数恶病质患者。

鉴定血型时要注意正反定型的结合，加用抗H和抗A，B型标准血清、A2红细胞等检查唾液中的血型物质，必要时作吸收放散试验以确定。