聚合酶链反应讲解
聚合酶链反应名词解释
聚合酶链反应名词解释
嘿，你知道啥是聚合酶链反应不？这可老重要啦！聚合酶链反应啊，就好比是一个超级厉害的复制机器！比如说，你有一段特别重要的基
因片段，就像你有一个特别宝贝的小物件。
聚合酶链反应就能把这个
基因片段不断地复制、复制再复制！这不就跟你有个宝贝，然后用个
超级机器给你变出好多好多一样的宝贝来一样嘛！
它的原理呢，也不难理解。
就好像搭积木一样，一步一步来。
先有
个模板，就像是搭积木的基础形状，然后聚合酶就像个小手，把需要
的东西一个一个加进去。
聚合酶链反应的应用那可多了去了！在医学上，能检测疾病呢，哎呀，这可太重要了吧！就好像是医生有了一双能看穿疾病的眼睛一样。
在科研上，也是个大功臣呀，能帮助科学家们解开好多好多的秘密呢！
总之，聚合酶链反应真的是个超厉害的东西呀，你说是不是？我的
观点就是聚合酶链反应是一项极其重要且神奇的技术，对我们的生活
和科学研究有着巨大的影响！。
聚合酶链式反应PCR基本原理
• ④两引物间不应存在互补序列，尤其是防止3′ 端旳互补重叠。
• ⑤引物与非特异扩增序列旳同源性<70%。
• ⑥引物旳3′端碱基一定要与模板互补配对；而 5′则可相对不严，甚至还可做某些修饰。
• 2、PCR旳模板
• 欲扩增旳核酸片段是PCR旳模板。
• 能够是DNA，也能够是RNA。当用RNA作模板时， 首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正 常旳PCR循环。
3、耐热旳DNA聚合酶
• 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键旳原因 之一。TaqDNA聚合酶是目前PCR中应用最广 泛旳耐热DNA聚合酶。
• TaqDNA聚合酶旳功能是：以DNA为模板，以 四种dNTP为原料，以引物3′端为出发点， 按5′→3′旳方向，以碱基配对方式合成 新旳DNA链。
寡核苷酸。
• 引物决定PCR扩增产物旳特异性和长度。 • PCR引物旳设计与PCR反应旳成败关系亲密。 • PCR反应中旳引物有两条，即5′端引物和3′
端引物，分别与相应旳模板链互补。
• 引物设计遵照下列原则：
• ①引物长度一般为15～30个核苷酸。
• ②引物中碱基旳分布尽量随机，尽量防止多聚 嘌呤或多聚嘧啶。
二、PCR旳基本原理
• PCR技术实际上是DNA旳体外扩增技术。 • 其原理类似于DNA在体内旳复制过程。 • 反应条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA
聚合酶、四种dNTP原料和合适旳缓冲液体系， 在一定旳温度下，经过反复旳过程，就能够 完毕DNA旳体外合成。
• 这些过程都是经过控制温度来实现旳，即经 过 变 化 温 度 引 起 变 性 （ denature ） 、 退 火 （ annealing ） 和 延 伸 （ extension ） ， 使 DNA得以复制。
聚合酶链式反应ppt课件
Extension 72˚C
Annealing
Tm-5˚C
PCR的基本过程
1.变性：将反应体系升温至95℃左右，样品中 双 链 DNA 解 开 成 两 条 单 链 ， 各 自 作 为 模 板 （待拷贝的 DNA 称为模板）。
2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55℃左 右)，5’端和3’端的引物各自与两条单链DNA 模板的互补区域结合。
(1944-)
1983 年提出PCR方法 1993年度诺贝尔化学奖
第一节 PCR技术的原理和特点
一、PCR基本原理
• PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生 物体内的DNA复制过程。
• 依据DNA半保留复制的机理。 • PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。
细胞内复制的过程
1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解 链成两条单链，各自作为模板。
RNA样品必须先经过逆转录 生成cDNA， cDNA作为PCR扩增 的模板。这个技术称为逆转录 PCR（RT-PCR）。
3. 常见的扩增对象(含核酸的标本)：
• 病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺 旋体、立克次体、支原体等。
• 病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、 羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养 细胞系。
（五） Mg2+
• Mg2+：为Taq 酶的必需激活剂。 浓度为0.5~2.5mmol/L。
太少：酶活性明显降低； 太多：导致非特异性扩增。
反应温度和时间
1. 变性： 95℃，30”~1’
双链DNA变成单链。
2. 退火：55℃，30”~1’
引物与模板互补结合。退火温度对特异性影响很大。
退火温度=Tm值-(5～10℃)
5. 模板量要合适，一般为102~105拷贝。
第十三章聚合酶链式反应PCR
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②退火:变性DNA分子在温度降至适 当时，重新形成双螺旋结构，该过 程称为退火。在PCR过程中,当温度 降至45-55℃时，单链DNA模板与人 工合成的引物DNA结合.
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③延伸:当PCR温度升至70-75℃度时， 在加入的DNA聚合酶的催化作用下， 体系中的4种游离的dNTP遵循碱基互 补原则，按引物5'→3'方向合成模 板DNA新的互补链。
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⒎引物的5’端可以修饰: 引物5’端不 互补不影响PCR，可以修饰，包括加接限 制酶识别序列或密码子序列，引入突变 位点或末端标记
⒏引物应严格特异: 为防止非特异性扩 增，引物与样品中的其他序列应无明显 同源性，一般同源性不超过70%。
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⒐引物量合适 在PCR体系中，每条引物 的浓度应为0.1-1μmol或10-100pmol。 引物浓度过高会引起错配和增加引物之 间形成二聚体的机会，发生非特异性扩 增。
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二、PCR的特点
⒈特异性强 扩增的目的DNA，可以 是DNA混合物中的某个特定分子，也 可以是DNA大分子的某段特定序列
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⒉灵敏度高 应用PCR技术可以对一 根毛发、一滴血、甚至一个细胞中 得到的DNA片段进行扩增、分析和鉴 定。在病毒学检测中，PCR的灵敏度 可达3个RFU(空斑形成单位)；在细 菌学检测中，PCR的最小检出率为3 个细菌。
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定量PCR技术：竞争定量PCR 实时荧光定量PCR
定量PCR技术与逆转录结合，可以 检测mRNA的绝对含量。
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⒊多重PCR 被检基因太长(2kb以上) 存在多个
位置的缺失和突变 方法：用多对引物同时扩增一份DNA样
品的不同序列区域，每对引物所扩 增产物长度不同，根据电泳结果判 断是否存在某些基因片段得缺失或 长度改变。这样一次反应就可以检 测多个变异位点。
《聚合酶链式反应技术》 知识清单
《聚合酶链式反应技术》知识清单聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称 PCR）技术是现代分子生物学领域中的一项关键技术，它具有极其重要的应用价值。
一、PCR 技术的原理PCR 技术的基本原理其实并不复杂。
想象一下，我们有一条很长的DNA 链，就像一条长长的绳子。
我们的目标是把其中特定的一小段“剪”下来并进行大量复制。
首先，我们要知道这段特定 DNA 片段的两端序列，然后根据这两端的序列设计出一对引物。
引物就像是两个小钩子，能够特异性地与目标 DNA 片段的两端结合。
接下来，把 DNA 模板、引物、四种脱氧核苷酸（dNTPs）、耐高温的 DNA 聚合酶（比如 Taq 聚合酶）以及合适的反应缓冲液混合在一起，放入 PCR 仪中。
PCR 仪会按照设定的程序，先将反应体系加热到 90-95℃，使 DNA 双链变性，变成两条单链。
然后，温度降低到 50-65℃，引物与单链DNA 结合，这一步叫做退火。
最后，温度升高到 70-75℃，DNA 聚合酶沿着引物的方向合成新的 DNA 链，这就是延伸。
这样，经过一个循环，原来的一条DNA 双链就变成了两条。
然后，再经过多次这样的循环，目标 DNA 片段就会以指数形式大量扩增。
二、PCR 技术的反应体系一个完整的 PCR 反应体系通常包括以下几个主要成分：1、 DNA 模板：这是我们要扩增的对象，可以是基因组 DNA、质粒 DNA 或者 cDNA 等。
2、引物：引物是决定 PCR 特异性和扩增效率的关键因素。
它们是一小段人工合成的寡核苷酸序列，通常长度在 18-30 个碱基之间。
3、四种脱氧核苷酸（dNTPs）：包括 dATP、dTTP、dCTP 和dGTP，它们是合成新 DNA 链的原料。
4、 DNA 聚合酶：常见的有 Taq 聚合酶，具有耐高温的特性，能够在高温条件下保持活性。
5、反应缓冲液：提供合适的离子强度、pH 值等反应条件，以保证反应的顺利进行。
聚合酶链反应及其应用课件
DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA链的物理损伤 PCR反应体系的洁净度
•聚合酶链反应及其应用
•7
DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响
DNA聚合酶的保真性主要取决于其3’→5’的核酸外切酶活性，它 负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的 出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 X 10–6 - 2.1 X 10–4范围内。DNA聚合 酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：
模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般
而言，模板DNA长度小，PCR扩增产物的量就大，因此对于大分子 量的模板DNA（尤其是真核生物基因组DNA），在扩增之前最好先 用超声波处理或限制性酶消化。
•聚合酶链反应及其应用
•21
4 PCR的引物设计及合成
PCR引物的设计原则 引物的在线设计工具及免费软件简介 PCR引物的使用
Taq DNA酶在使用时应注意：
避免稀释保存Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性
•聚合酶链反应及其应用
•9
用于PCR的DNA聚合酶简介
KlenTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）
KlenTaq DNA聚合酶是一种N端缺失了的Taq DNA聚合酶，因而 没有5’的核酸外切酶活性；
•聚合酶链反应及其应用
•19
粗样品中的PCR抑制剂
粪便 胆盐、胆红素（抑制浓度50mg / mL） 血液 亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、heparin（抗凝剂） 植物 硫酸右旋糖苷 土壤 腐殖物质、含铁化合物 食品 未鉴定的抑制剂 痰液 未鉴定的抑制剂
•聚合酶链反应及其应用
•20
PCR模板的使用
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA 混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4)生成大量DNA以进行序列测定；(5)突变的分析；(6)染色体步移；(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μldNTP mix （2mM） 4 μl引物1（10pM） 2 μl引物2（10pM） 2 μlTaq酶（2U/μl） 1 μlDNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl加ddH2O至 50 μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
聚合酶链反应的原理和过程
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的原理和过程1. 引言聚合酶链反应（PCR）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR的原理基于DNA的复制过程，通过重复进行一系列的温度变化和酶催化反应，使得DNA模板序列得以扩增。
PCR技术的发展极大地促进了基因组学、遗传学、医学诊断和犯罪学等领域的研究。
2. PCR的基本原理PCR技术借助于DNA聚合酶这个酶来实现DNA片段的扩增。
其基本原理可以概括为三个步骤：变性、退火和延伸。
2.1 变性首先，在高温条件下（通常为94-98摄氏度），将待扩增样品中的双链DNA解链成两条单链模板。
这一步被称为变性（Denaturation），其目的是打破氢键连接，使双链DNA分离成两条单链。
2.2 退火接下来，在较低温度（通常为50-65摄氏度），通过引入一组特异性的引物（即寡核苷酸引物，通常为20-30个碱基），使其与目标DNA序列的两端互补结合。
这一步被称为退火（Annealing），其目的是将引物定位在待扩增的DNA序列上。
2.3 延伸最后，在适宜温度下（通常为72摄氏度），加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），使其沿着引物向3’端延伸，合成新的DNA链。
这一步被称为延伸（Extension）或扩增，其目的是合成与模板DNA相对应的新链。
通过重复进行上述三个步骤，PCR技术可以在相对短的时间内从少量起始DNA扩增出大量特定片段的DNA。
3. PCR反应体系PCR反应体系由以下几个关键组分组成：3.1 DNA模板PCR反应需要待扩增的DNA片段作为模板。
模板可以是从细胞提取得到的基因组DNA、cDNA、质粒等。
3.2 引物PCR反应需要两条引物，分别位于待扩增序列的两端。
引物是由碱基组成的短链RNA或DNA分子，具有与待扩增序列互补的碱基序列。
引物的设计十分重要，需要确保其与待扩增序列的特异性结合，避免与其他非目标DNA结合。
聚合酶链反应
• 引物的浓度:
PCR反应体系中引物浓度一般在0.1～0.2μmol/L 之间. • 引物浓度过高:易形成引物二聚体且产生非特 异性产物. • 引物浓度过低:不足以完成30个循环的扩增反 应,则会降低PCR的产率.
• 3.脱氧核苷三磷酸(dNTP) 即dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP四种脱氧 核苷三磷酸的混合物.
• (3)延伸温度: • 温度：建议选择在70~75℃之间，此时Taq DNA聚 合酶具有最高活性。温度过高不利于引物和 模板结合。
时间：根据待扩增片段的长度而定。72 ℃时核苷酸 掺入率为35～100个核苷酸/秒。
• 2.循环时间
• PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增 • 片断的长度. • 在模板(主要是基因组DNA)进行第一次变性时 • 应给予足够长的时间(5～7min,根据变性 温度高低 • 而异)以使模板彻底变性,然后进入循环. • 以长度为200～1000bp扩增片断为例,循环中变性、 • 退火和延伸3个步骤的持续时间均为30s～1min.若扩 • 增片断长度 ＞2kb,应适当延长每个步骤的持续时间, • 但延伸时间过长易导致非特异性扩增.
• 循环时: • 模板DNA 94℃变性1min,引物与模板40～ 60℃退火1min,72℃延伸2min.循环25～40圈 在首次循环前模板预变性3～5min;在末次循环后, 样品仍需继续延伸3～5min以上,确保扩增的DNA 为双链DNA. 经此循环扩增后使被测的单拷贝基因成为超拷贝 基因.
• 三.聚合酶链反应原理 • • PCR反应重复进行DNA复制的过程,使DNA得
• (3)两条引物之间的序列不能有互补. • • 特别是在引物3’端,以免形成引物二聚体. *两条引物之间避免有同源序列,尤为连续4个以 上相同碱基的寡核苷酸片段,否则两条引物会相 互竞争模板的同一位点;同样,引物与待扩增靶 DNA或样品DNA的其它序列也不能存在4个以上 碱基的同源序列.否则,引物就会与其它位点结合, 使特异扩增减少,非特异扩增增加.
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应简介聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因分析、基因工程、医学诊断等领域。
PCR 能够快速、高效地扩增特定DNA片段，使得原本数量有限的DNA样本得以增加，从而便于进行后续实验。
PCR的核心原理是利用DNA聚合酶酶活性，通过不断重复三个步骤（变性、退火、延伸），在适宜的反应条件下，将目标DNA序列扩增至数百万份的数量。
依靠PCR技术，无需使用传统的细菌培养方法，仅需少量DNA样本和简单的实验设备，即可实现高效扩增目标DNA。
PCR反应步骤反应体系构建PCR反应所需的关键成分包括目标DNA模板、DNA聚合酶、引物（primer）、核苷酸和反应缓冲液。
引物是一对短的DNA片段，其序列与目标DNA序列上的起始和终止部分的互补序列匹配。
反应缓冲液是维持PCR反应过程中所需酶活性的化学平衡和适宜pH的缓冲物质。
变性PCR反应开始时，反应体系中的DNA样本被放置在高温环境中（通常为94-98摄氏度），使其双链DNA解离为两条单链DNA。
这个步骤可以通过加热反应体系来实现，高温会断裂氢键，使DNA的双链解开。
退火在反应体系降温至适宜的温度范围时（通常为50-65摄氏度），引物与目标DNA序列上的互补区域结合形成稳定的双链结构。
引物的选择非常重要，其应与目标DNA序列完全匹配，以确保选择性扩增。
延伸DNA聚合酶将新的核苷酸从反应缓冲液中获得，并在目标DNA的3’末端上依次加入。
这个过程被称为延伸，其速率与延伸温度和所用聚合酶的酶活性相关。
通常延伸温度为60-72摄氏度。
经过以上三个步骤的循环反复进行，每一轮都会使目标DNA序列数量翻倍。
因此，PCR可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。
PCR应用PCR技术在生物学研究、医学诊断、疾病预防和基因工程等领域有着广泛的应用。
基因分析PCR被广泛用于分析基因的结构和功能。
通过PCR，可以快速扩增出感兴趣的DNA片段，然后进行测序分析、限制性酶切或其他分子生物学实验，以研究目标基因的结构和功能。
定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)
定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）一、实验原理逆转录-聚合酶链反应(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
二、实验步骤（一）总RNA提取1.Trizol裂解收集各处理组细胞于1.5ml离心管，用PBS缓冲液洗涤1次，每5～10×106个细胞加入1ml Trizol，吹打数次，使细胞充分裂解，室温静置5min。
（裂解后若不能及提取RNA，可在加入Trizol后，将其保存于-80℃）2.氯仿（三氯甲烷）萃取（1）每管加入200ul氯仿（Trizol :氯仿= 5 : 1），盖好离心管后，涡旋震荡15s后，放置室温静置2min。
（2）4℃、12000rpm条件下离心15min后，溶液分为上、中、下3层，上层为水相（无色透明，含RNA），下层为有机层（粉红色，含DNA和蛋白质等）。
3.异丙醇沉淀（1）吸取上层水相（约500μL）至RNase-free离心管中。
（不要吸到中间层）（2）加入500μL异丙醇（与上层水相等量），颠倒混匀数次。
（不要剧烈摇晃）（3）4℃、12000rpm条件下离心15min后，吸弃上清液，保留底部白色沉淀。
4.75%乙醇洗涤沉淀（1）加入1mL 75%乙醇（现配现用，DEPC水:无水乙醇= 1:3，配制后上下颠倒混匀）洗涤沉淀，涡旋震荡。
（2）4℃、12000rpm条件下离心5min后，吸弃上清液，将离心管开盖干燥10min。
5. RNA干燥溶解每管加入50μL DEPC水，盖好离心管后，敲打溶解。
（二）RNA浓度和纯度检测1.提前10min对酶联免疫分析仪进行预热。
2.用DEPC水洗涤微量比色皿。
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术。
它利用DNA聚合酶在适当温度下的体外酶促反应，在较短时间内大量复制目标DNA片段，并使其扩增至可检测水平。
PCR包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤使DNA双链解开成两股单链，退火步骤使引物与目标DNA特异性结合，延伸步骤利用DNA聚合酶在合适温度下合成新DNA链。
这三个步骤连续循环进行，每一轮都会产生双倍数量的目标DNA。
PCR具有高度特异性、高灵敏性和高速度的特点，可以从少量的起始DNA样品中扩增出目标DNA片段，常用于分子生物学研究中的DNA定量、基因检测、基因测序、基因工程等多个领域。
聚合酶链反应
核酸扩增聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)由美国Centus公司的Kary Mullis发明，于1985年由Saiki等在Science杂志上首次报道，是近年来开发的体外快速扩增DNA的技术。
通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，并且有很高的灵敏度和特异性，可在动物检疫中用于微量样品的检测。
1. PCR的基本原理和过程PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR以欲扩增的DNA做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。
模板DNA变性、引物结合(退火)、引物延伸合成 DNA这三步构成一个PCR循环。
每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板 DNA。
这样，目的的DNA的数量将以2n -2n的形式累积，在2小时内可扩增30(n)个循环， DNA量达原来的上百万倍。
PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物和Mg2+ 存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链的延伸反应。
通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。
对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。
2.PCR反应条件和反应系统的组成(1) 反应条件PCR反应通过三种温度的交替循环来进行，一般94℃变性30秒，55℃退火 30秒，70-72℃延伸30-60秒，依此条件进行30次左右的循环。
(2) PCR反应系统的组成标准的PCR反应体系一般选用50-100μl体积，其中含有：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris.HCl(室温，pH8.3)，1.5mmol/L MgCl2明胶或牛血清白蛋白(BSA)，2种引物，各0.25(mol/L，4种脱氧核糖核苷酸底物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)各200( mol/L，模板 DNA 0.1(g，TaqDNA聚合酶2.5iu。
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AT GC AT AT CG TA TA
子代DNA
基本原理：
在模板、引物、4种dNTP和赖热 DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位 于两段已知序列之间的DNA区段的酶促 合成反应。
基本步骤： 变性：加热使双链DNA变为单链
退火：降温使引物和互补模板在局部 形成杂交链
延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向 催化以引物为起始点的延伸反应
（一）PCR引物设计原则
1、引物长度一般为15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性 降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA 聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本 增加。
2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积 现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在 模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在45~55% 左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。 Tm=4 （ G+C ） +2 （ A+T ） 。 引 物 长 度 要 确 保 解 链 温 度 不 低 于 54°C
三、模板制备
PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先 要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。大多数用途的 PCR反应中，对DNA模板的要求并不严格。首先对纯度要求不严。大量 的实验数据表明存在一定量的蛋白质，或SDS等对实验过程影响不大，所 以只要没有交叉污染，模板DNA的制备可以不必像克隆、酶切、连接、 标 记 等 反 应 所 用 DNA 制 备 那 样 严 格 。 其 次 ， 模 板 用 量 很 低 ， 理 论 上 102~104拷贝的模板是可满足各种要求的PCR反应。由于种种原因，准备 的模板量要求达一定水平。一方面可减少由于实验操作和实验精确度方面 等原因而引起的扩增失败，同时用作扩增的模板DNA量越多，由于交叉 污染引起的反应失败的可能性小。
病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、
立克次体、支原体等
病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液 等 法医学标本：血斑、精斑、毛发 考古标本
四、PCR基本反应
（一）以DNA为模板的反应
反应体积：50~100μl 缓冲液 引物 底物：4种dNTP 模板：102~105拷贝 TaqDNA聚合酶 矿物油 其中模板DNA的用量必须根据其分子量的大小加以调 整。
(二)循环参数数 变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度 和时间。94 ℃ ，1min；95 ℃ ，30 s ；97 ℃ ，15 s ；
退火温度和时间：45~55 ℃ ，30s~1min 延伸温度和时间：72 ℃ ，时间因扩增片段的长度而异： 1kb，1min；3~4kb,3~4min 循环次数：25~30次，视最初靶分子浓度而定 两步PCR：将退火和延伸温度合并为一个温度，采用二 温式两步PCR
4.耐热DNA聚合酶：2.5~5 u
在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之 一 。 PCR 发 明 的 初 期 使 用 的 DNA 聚 合 酶 是 Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶， 它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直 到耐热的DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 应 用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和 广泛应用。
一、PCR的基本原理 示意图
二、PCR引物设计
PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设 计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。 其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的 特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。
PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。设计引物 时，通常以信息链为基准，5′引物与位于待扩增片段5′ 上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模 板，引导信息链的合成，3′引物与扩增片段3′端的一小 段DNA序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增 的就是这一对引物之间的DNA片段。
（1）TaqDNA聚合酶
Taq DNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。 75~80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸， 70℃时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55℃时为 22个核苷酸/秒；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25 个核苷酸/秒。温度超过80℃时，合成速度明显下 降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。
Taq DNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性。没有校正功能的。 对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%～ 0.25%。Taq DNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已 知忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增 产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA 聚合酶。如Vent和Pfu DNA聚合酶。
（2）Tth DNA聚合酶
在95 0C半衰期为20分钟，具有逆转录酶 活性，可简化RT-PCR。但不具35外 切酶活性，没有校对功能，催化聚合反 应的错误掺入率为1/500
（3）Vent DNA聚合酶
该酶在1000C时半衰期达95分钟，97.50C 时半衰期长达130分钟，其扩增产物的长 度可达10~13kb。Vent DNA聚合酶具有 35外切酶活性，具有校对功能，错误 掺入率为1/31000，忠实性比TaqDNA聚 合酶提高510倍。
（二）引物设计的方法
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序 列到特定网页，(在线引物设计的网站有： http://cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3–www.cgi; /cgi-bin/SGD/web-primer; http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi; /~urolab/methprimer/index1.html; /rawprimer.html)得到设计好的引物，也可 以在本地计算机上运行引物设计专业软件。软件的引物设计功能主 要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商 业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最为优秀；其次是引物的自动 搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果
（二）以mRNA为模板的反应 以mRNA为原始模板进行的PCR
反应称为逆转录PCR
一）逆转录反应体系
体积：20 μ l 缓冲液 底物：4种dNTP 引物：oligo(dT)12~18 模板：RNA 逆转录酶 其他试剂：RNA酶抑制剂， MgCl2.DTT.牛血清白蛋白 二）PCR反应体系同以DNA模
2.镁离子浓度：1.5mmol/L Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+ 浓度过低， 会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特 异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模 板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产 率。
在PCR反应中，Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。 其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可 与 Mg2+ 结 合 而 降 低 游 离 Mg2+ 浓 度 ， 从 而 影 响 Taq DNA聚合酶的活性。 常用1.5mmol/L 。
板的反应体系
（三）PCR产ห้องสมุดไป่ตู้的积累规律
在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。 反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐 渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的 催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对 稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平 台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩 增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等 因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上 PCR循环。
（4）Pfu DNA聚合酶
此酶耐热性极好，在97.50C半衰期大于3 小时，具有35外切酶活性，催化DNA 合成的忠实性比Taq DNA聚合酶高12倍。
4.引物：0.1~0.5 μmol/L
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
PCR产物的积累规律示意图
五、PCR反应条件的控制
(一) 标准PCR反应流程
1.反应体系：标准PCR反应体积为50~100μl,其 中含有缓冲液，4种底物，引物，DNA模板和 耐热DNA聚合酶。
2.反应步骤：加入各种试剂，950C热变性5~10 分钟，使模板DNA充分变性，同时除去蛋白酶， 氯仿对耐热DNA聚合酶的影响。然后加入 2UTaqDNA聚合酶，加50μl液体石蜡封盖反应 体系，防止液体挥发。进行PCR反应。但 PE9700仪设计了热盖，不需加液体石蜡。
3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按 经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。
4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。
5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端 连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致 非特异性扩增。
(三)PCR反应成分
1.PCR反应的缓冲液：10~50mmol/L Tris-Cl 缓冲 液，72℃ 时pH7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含 50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将 会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基 亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。
3.底物浓度：20~200μmol/L
dNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值 调 至 7.0~7.5 ， 分 装 小 管 ， 于 -20℃ 存 放 ， 过 多 冻 融 会 使 dNTP产生降解。
在PCR反应中，dNTPs浓度在20~200μmol/L, dNTP浓度 过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和 实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降， 但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用 时必须以等摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用 效率。