乳链菌肽发酵玉米浆_糖蜜培养基的优化制备
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( College of L if e Science , Jili n U niversity , Changchun 130012 , Chi na)
Abstract
This work reviewed fermentation medium cult ure of nisin by single factor experiment . The result s indicate t hat nisin activity was mainly influenced of molasses , corn steep liquor , K2 HPO4 and MgSO4 . Box2Behnken design and response surface analysis met hods were applied to confirm optimum concent ration of mainly effect factor. The result s show t hat t he optimum medium cult ure was corn steep liquor 233 g/ L , molasses 27 g/ L , K2 HPO4 5 g/ L , MgSO4 011 g/ L . Under t hose conditions , nisin activity is 2 49118 IU/ mL , which is in consistent wit h predicted value 2 51111 IU/ mL .
Fig. 4 Effects of MgSO4 on nisin activity
212
Box2Behnken
试验设计和响应面法分析
采用 Box2Behnken 设计结合响应面分析方法 ,
以玉米浆 、糖蜜 、MgSO4 、K2 HPO4 的质量浓度4 个因 素为自变量 ,以乳链菌肽的效价为响应值 ,对乳链菌
关键词 : 乳链菌肽 玉米浆 糖蜜 Box2Behnken 设计 响应面法
中图分类号 : TS20213
文献标识码 : A
Optimization Corn Steep Liquor - Molasses Fermentation Medium f or Nisin
L u J iahui Sun Ying J iang Liyan Meng Qingfan Li Yang Teng Lirong
2 结果与分析
211 单因素试验 21111 玉米浆
由试验结果可知 ,在测试的胰蛋白胨 、玉米浆 、 稻糠和豆饼 4 种氮源中 ,玉米浆对乳链菌肽效价的
图 2 糖蜜对乳链菌肽效价的影响曲线
Fig. 2 Effects of molasses on nisin activity
21113 K2 HPO4 从图 3 可以看出 , K2 HPO4 的质量浓度为 7 g/ L
目前 ,国内外对乳链菌肽发酵培养基的研究有 很多报道 ,但常用的培养基一般为 CM 培养基[4 ] 、 SM8 培养基[5 ] 、M17S 培养基[6 ] ,这些培养基的发酵 原料成本昂贵 ,制约了规模化生产 ,限制了乳链菌肽 的应用 。
糖蜜是制糖工业的一种副产物 ,其总糖质量分
数可达 50 %～60 % ,同时还含有大量的有机或无机 物质 。由于其价格低廉 ,且资源化利用的工艺简单 , 因此是一种很重要的发酵原料[7 ] 。玉米浆是制玉 米淀粉的副产物 ,含有丰富的可溶性蛋白 、生长素和 一些前体物质 ,是微生物生长普遍应用的有机氮源 。
2009年7月
农业机械学报
第 40 卷 第 7 期
乳链菌肽发酵玉米浆 - 糖蜜培养基的优化制备 3
逯家辉 孙 莹 姜丽艳 孟庆繁 李 扬 滕利荣
(吉林大学生命科学学院 , 长春 130012)
【摘要】 采用单因素试验方法对影响乳链菌肽效价的培养基组分进行了考察 。结果表明 ,影响乳链菌肽效价
表 1 因素水平表
Tab. 1 Design of factors and levels
g/ L
水 平 玉米浆质量
浓度
-1
150
因素
糖蜜质量 浓度
MgSO4 质量浓度
20
012
K2 HPO4 质量浓度
5Leabharlann Baidu
0
200
30
015
7
1
250
40
018
9
图 3 K2 HPO4 对乳链菌肽效价的影响
Fig. 3 Effects of K2 HPO4 on nisin activity
的主要因素为糖蜜 、玉米浆 、K2 HPO4 、MgSO4 。在此基础上 ,采用 Box2Behnken 设计及响应面分析法确定主要影响
因子的最佳质量浓度 。结果表明 ,当玉米浆质量浓度为 233 g/ L ,糖蜜质量浓度为 27 g/ L , K2 HPO4 质量浓度为
510 g/ L ,MgSO4 质量浓度为 011 g/ L 时 ,乳链菌肽效价为 2 49118 IU/ mL ,与预测值 2 51111 IU/ mL 基本一致 。
种子培养基 : 蛋白胨 1010 g/ L , K2 HPO4 ·3 H2O 310 g/ L , 葡萄糖 510 g/ L , MgSO4 ·7 H2O 012 g/ L 。 发酵培养基 : 葡萄糖 510 g/ L ,胰蛋白胨 1510 g/ L , K2 HPO4·3 H2O 310 g/ L ,MgSO4·7 H2O 012 g/ L 。效 价检测培养基参照文献 [ 8 ] 。效价检测菌发酵培养 基参照文献[ 9 ] 。 113 原材料
选玉米浆作为乳链菌肽发酵培养基的氮源 ,对 玉米浆的最佳质量浓度进行考察 ,试验结果如图 1 所示 。
图 1 玉米浆对乳链菌肽效价的影响曲线 Fig. 1 Effects of corn steep liquor on nisin activity
由图 1 可知 ,当玉米浆的质量浓度提高时 ,体系 营养增加 ,有利于菌体生长繁殖 ,使得发酵液中乳链 菌肽的活性增加 。但加入的营养过多 ,反而抑制了 菌体的生长 ,从而使乳链菌肽的活性下降 。因此选 取玉米浆的最佳质量浓度为 200 g/ L 。 21112 糖蜜
本文以玉米浆 、糖蜜为主要发酵原料 ,以乳链菌 肽的效价为指标 ,通过统计学分析方法优化乳链菌 肽的发酵培养基 ,以得出最优的乳链菌肽废料发酵 培养基成分 。
1 材料与仪器
111 菌种 Nisin 产 生 菌 株 : l actococcus L actis AS112030 ,
收稿日期 : 2008 - 07 - 07 修回日期 : 2008 - 12 - 21 3 2006 年吉林大学国家级生物实验教学示范中心设计创新实验基金一类资助项目 ( ZXCX 2006019) 作者简介 : 逯家辉 ,高级工程师 ,主要从事微生物菌种选育及其发酵工艺研究 , E2mail : lu443 @126. com 通讯作者 : 滕利荣 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事微生物与生化药学研究 , E2mail : tenglr @jlu. edu. cn
Key words Nisin , Corn steep liquor , Molasses , Box2Behnken design , Response surface met hodology
引言
乳链菌肽 (Nisin) 是一种天然的食品防腐剂[1 ] 。 它能有效地延长食品变质期和货架寿命 ,对人体无 毒 、无害 ,且具有医药价值 ,发展前景广阔[2 ] 。而利 用安全高效生物防腐剂代替化学防腐剂已成为一种 趋势[3 ] 。
第 7 期 逯家辉 等 : 乳链菌肽发酵玉米浆 - 糖蜜培养基的优化制备
159
购于中国科学院微生物所菌种保藏中心 。效价检测 菌株 : B acill us S ubtilis AS11108 ,购于中国科学院微 生物所菌种保藏中心 。乳链菌肽标准品 , Sigma 公 司生产 。 112 培养基
(2) 发酵培养基中其余成分不变 ,选择质量浓 度均为 510 g/ L 的葡萄糖 、糖蜜 、红糖 、蔗糖作为碳 源 ,确定合适的碳源 ,并对最佳的碳源质量浓度进行 优化 。
(3) 选 K2 HPO4 作为乳链菌肽发酵培养基的磷 酸盐 ,对 K2 HPO4 的最佳质量浓度进行考察 。
(4) 选 MgSO4 作为乳链菌肽发酵培养基的无 机盐 ,对 MgSO4 的最佳质量浓度进行考察 。 11512 Box2Behnken 设计
-
871358
X4
-
4991490
X
2 1
-
1671114 X1 X2 - 4161712 X1 X3 - 1491365 X1 X4 -
5421646
21114
MgSO4
由图 4 可见 ,添加 015 g/ L 的 MgSO4 时 ,乳链
菌肽效价最高 。这是由于 Mg2 + 可通过保护细胞质
膜完整性来增强 Nisin 对主要肽酶 NisP 的免疫力 ,
或是降低 Nisin 在细胞表面的吸附[14 ] 。
图 4 MgSO4 对链菌肽效价的影响曲线
肽的发酵培养基组分进行优化 。试验因素与水平设
计见表 1 。响应面试验方案及结果见表 2 。回归分
析结果见表 3 。经过 SASV810 对 Box2Behnken 数
据进行处理 ,得到二次响应面回归方程为
Y = 2 3551315 + 4251943 X1 + 281793 X2 -
361462 X3
在单 因 素 试 验 设 计 的 基 础 上 , 采 用 Box2 Behnken 设计对培养基组分进一步优化 ,运用响应 面分析确定主要影响因素的最佳质量浓度 。
影响最大 。这是因为玉米浆富含维生素 、生物素 、嘌 呤 、嘧啶等微量有机质[12 ] ,对前期菌体的生长会有 促进作用 ,从而提高了乳链菌肽的效价 。
时 ,乳链菌肽效价最高 。当 K2 HPO4 的质量浓度低
160
农 业 机 械 学 报 2 0 0 9 年
于 7 g/ L 时 ,乳链菌肽的效价随着 K2 HPO4 质量浓 度的增加而增加 ;高于 7 g/ L 时 ,乳链菌肽的效价却 随着 K2 HPO4 质量浓度的增加而降低 。因此选择 K2 HPO4 的最佳质量浓度是 7 g/ L 。
由试验结果可知 ,在葡萄糖 、糖蜜 、红糖 、蔗糖 4 种碳源中 ,糖蜜对乳链菌肽的效价影响显著 , 为 45010 IU/ mL ,优于蔗糖 ,原因是糖蜜中富含多种糖 分 、天然矿物质及维生素 ,而乳酸链球菌有一个有效 的磷酸转移酶系统作为糖蜜的吸收 、运输及代谢途 径[13 ] 。以下实验均选糖蜜作为乳链菌肽发酵的碳 源 。对糖蜜的最佳质量浓度进行考察 ,试验结果如 图 2 所示 。由图 2 可知 ,糖蜜质量浓度小于 30 g/ L 时 ,随着糖蜜质量浓度的增加 ,乳链菌肽的效价也逐 渐增加 ,糖蜜的质量浓度大于 30 g/ L 时 ,反而对乳 链菌肽的活性产生了抑制作用 ,因此 ,选取糖蜜的最 佳质量浓度是 30 g/ L 。
(1) 选择胰蛋白胨 、玉米浆 、稻糠 、豆饼 (质量浓 度均为 1510 g/ L ) 配制乳链菌肽发酵培养基 ,其他 组分 为 葡 萄 糖 510 g/ L 、K2 HPO4 ·3 H2O 310 g/ L 、 MgSO4·7 H2O 012 g/ L ,确定合适氮源 ,并对其质量 浓度进行优化 。
玉米浆 、糖蜜由长春大成实业有限公司提供 (玉 米浆为液体 ,质量浓度为 1 g/ L) 。 114 培养条件
将菌种接于活化培养基 ,斜面培养 24 h ,再转接 于种子培养基 ,培养温度 30 ℃,摇床转速 140 r/ min 下培养 12 h 。发酵培养条件 : 接种量 5 % ( 体积分 数) , 培养温度 30 ℃, 摇床转速 140 r/ min 下 培 养 24 h 。效 价 检 测 采 用 双 层 琼 脂 扩 散 法 , 参 照 文 献[ 10～11 ] 。 115 试验设计 11511 单因素试验
Abstract
This work reviewed fermentation medium cult ure of nisin by single factor experiment . The result s indicate t hat nisin activity was mainly influenced of molasses , corn steep liquor , K2 HPO4 and MgSO4 . Box2Behnken design and response surface analysis met hods were applied to confirm optimum concent ration of mainly effect factor. The result s show t hat t he optimum medium cult ure was corn steep liquor 233 g/ L , molasses 27 g/ L , K2 HPO4 5 g/ L , MgSO4 011 g/ L . Under t hose conditions , nisin activity is 2 49118 IU/ mL , which is in consistent wit h predicted value 2 51111 IU/ mL .
Fig. 4 Effects of MgSO4 on nisin activity
212
Box2Behnken
试验设计和响应面法分析
采用 Box2Behnken 设计结合响应面分析方法 ,
以玉米浆 、糖蜜 、MgSO4 、K2 HPO4 的质量浓度4 个因 素为自变量 ,以乳链菌肽的效价为响应值 ,对乳链菌
关键词 : 乳链菌肽 玉米浆 糖蜜 Box2Behnken 设计 响应面法
中图分类号 : TS20213
文献标识码 : A
Optimization Corn Steep Liquor - Molasses Fermentation Medium f or Nisin
L u J iahui Sun Ying J iang Liyan Meng Qingfan Li Yang Teng Lirong
2 结果与分析
211 单因素试验 21111 玉米浆
由试验结果可知 ,在测试的胰蛋白胨 、玉米浆 、 稻糠和豆饼 4 种氮源中 ,玉米浆对乳链菌肽效价的
图 2 糖蜜对乳链菌肽效价的影响曲线
Fig. 2 Effects of molasses on nisin activity
21113 K2 HPO4 从图 3 可以看出 , K2 HPO4 的质量浓度为 7 g/ L
目前 ,国内外对乳链菌肽发酵培养基的研究有 很多报道 ,但常用的培养基一般为 CM 培养基[4 ] 、 SM8 培养基[5 ] 、M17S 培养基[6 ] ,这些培养基的发酵 原料成本昂贵 ,制约了规模化生产 ,限制了乳链菌肽 的应用 。
糖蜜是制糖工业的一种副产物 ,其总糖质量分
数可达 50 %～60 % ,同时还含有大量的有机或无机 物质 。由于其价格低廉 ,且资源化利用的工艺简单 , 因此是一种很重要的发酵原料[7 ] 。玉米浆是制玉 米淀粉的副产物 ,含有丰富的可溶性蛋白 、生长素和 一些前体物质 ,是微生物生长普遍应用的有机氮源 。
2009年7月
农业机械学报
第 40 卷 第 7 期
乳链菌肽发酵玉米浆 - 糖蜜培养基的优化制备 3
逯家辉 孙 莹 姜丽艳 孟庆繁 李 扬 滕利荣
(吉林大学生命科学学院 , 长春 130012)
【摘要】 采用单因素试验方法对影响乳链菌肽效价的培养基组分进行了考察 。结果表明 ,影响乳链菌肽效价
表 1 因素水平表
Tab. 1 Design of factors and levels
g/ L
水 平 玉米浆质量
浓度
-1
150
因素
糖蜜质量 浓度
MgSO4 质量浓度
20
012
K2 HPO4 质量浓度
5Leabharlann Baidu
0
200
30
015
7
1
250
40
018
9
图 3 K2 HPO4 对乳链菌肽效价的影响
Fig. 3 Effects of K2 HPO4 on nisin activity
的主要因素为糖蜜 、玉米浆 、K2 HPO4 、MgSO4 。在此基础上 ,采用 Box2Behnken 设计及响应面分析法确定主要影响
因子的最佳质量浓度 。结果表明 ,当玉米浆质量浓度为 233 g/ L ,糖蜜质量浓度为 27 g/ L , K2 HPO4 质量浓度为
510 g/ L ,MgSO4 质量浓度为 011 g/ L 时 ,乳链菌肽效价为 2 49118 IU/ mL ,与预测值 2 51111 IU/ mL 基本一致 。
种子培养基 : 蛋白胨 1010 g/ L , K2 HPO4 ·3 H2O 310 g/ L , 葡萄糖 510 g/ L , MgSO4 ·7 H2O 012 g/ L 。 发酵培养基 : 葡萄糖 510 g/ L ,胰蛋白胨 1510 g/ L , K2 HPO4·3 H2O 310 g/ L ,MgSO4·7 H2O 012 g/ L 。效 价检测培养基参照文献 [ 8 ] 。效价检测菌发酵培养 基参照文献[ 9 ] 。 113 原材料
选玉米浆作为乳链菌肽发酵培养基的氮源 ,对 玉米浆的最佳质量浓度进行考察 ,试验结果如图 1 所示 。
图 1 玉米浆对乳链菌肽效价的影响曲线 Fig. 1 Effects of corn steep liquor on nisin activity
由图 1 可知 ,当玉米浆的质量浓度提高时 ,体系 营养增加 ,有利于菌体生长繁殖 ,使得发酵液中乳链 菌肽的活性增加 。但加入的营养过多 ,反而抑制了 菌体的生长 ,从而使乳链菌肽的活性下降 。因此选 取玉米浆的最佳质量浓度为 200 g/ L 。 21112 糖蜜
本文以玉米浆 、糖蜜为主要发酵原料 ,以乳链菌 肽的效价为指标 ,通过统计学分析方法优化乳链菌 肽的发酵培养基 ,以得出最优的乳链菌肽废料发酵 培养基成分 。
1 材料与仪器
111 菌种 Nisin 产 生 菌 株 : l actococcus L actis AS112030 ,
收稿日期 : 2008 - 07 - 07 修回日期 : 2008 - 12 - 21 3 2006 年吉林大学国家级生物实验教学示范中心设计创新实验基金一类资助项目 ( ZXCX 2006019) 作者简介 : 逯家辉 ,高级工程师 ,主要从事微生物菌种选育及其发酵工艺研究 , E2mail : lu443 @126. com 通讯作者 : 滕利荣 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事微生物与生化药学研究 , E2mail : tenglr @jlu. edu. cn
Key words Nisin , Corn steep liquor , Molasses , Box2Behnken design , Response surface met hodology
引言
乳链菌肽 (Nisin) 是一种天然的食品防腐剂[1 ] 。 它能有效地延长食品变质期和货架寿命 ,对人体无 毒 、无害 ,且具有医药价值 ,发展前景广阔[2 ] 。而利 用安全高效生物防腐剂代替化学防腐剂已成为一种 趋势[3 ] 。
第 7 期 逯家辉 等 : 乳链菌肽发酵玉米浆 - 糖蜜培养基的优化制备
159
购于中国科学院微生物所菌种保藏中心 。效价检测 菌株 : B acill us S ubtilis AS11108 ,购于中国科学院微 生物所菌种保藏中心 。乳链菌肽标准品 , Sigma 公 司生产 。 112 培养基
(2) 发酵培养基中其余成分不变 ,选择质量浓 度均为 510 g/ L 的葡萄糖 、糖蜜 、红糖 、蔗糖作为碳 源 ,确定合适的碳源 ,并对最佳的碳源质量浓度进行 优化 。
(3) 选 K2 HPO4 作为乳链菌肽发酵培养基的磷 酸盐 ,对 K2 HPO4 的最佳质量浓度进行考察 。
(4) 选 MgSO4 作为乳链菌肽发酵培养基的无 机盐 ,对 MgSO4 的最佳质量浓度进行考察 。 11512 Box2Behnken 设计
-
871358
X4
-
4991490
X
2 1
-
1671114 X1 X2 - 4161712 X1 X3 - 1491365 X1 X4 -
5421646
21114
MgSO4
由图 4 可见 ,添加 015 g/ L 的 MgSO4 时 ,乳链
菌肽效价最高 。这是由于 Mg2 + 可通过保护细胞质
膜完整性来增强 Nisin 对主要肽酶 NisP 的免疫力 ,
或是降低 Nisin 在细胞表面的吸附[14 ] 。
图 4 MgSO4 对链菌肽效价的影响曲线
肽的发酵培养基组分进行优化 。试验因素与水平设
计见表 1 。响应面试验方案及结果见表 2 。回归分
析结果见表 3 。经过 SASV810 对 Box2Behnken 数
据进行处理 ,得到二次响应面回归方程为
Y = 2 3551315 + 4251943 X1 + 281793 X2 -
361462 X3
在单 因 素 试 验 设 计 的 基 础 上 , 采 用 Box2 Behnken 设计对培养基组分进一步优化 ,运用响应 面分析确定主要影响因素的最佳质量浓度 。
影响最大 。这是因为玉米浆富含维生素 、生物素 、嘌 呤 、嘧啶等微量有机质[12 ] ,对前期菌体的生长会有 促进作用 ,从而提高了乳链菌肽的效价 。
时 ,乳链菌肽效价最高 。当 K2 HPO4 的质量浓度低
160
农 业 机 械 学 报 2 0 0 9 年
于 7 g/ L 时 ,乳链菌肽的效价随着 K2 HPO4 质量浓 度的增加而增加 ;高于 7 g/ L 时 ,乳链菌肽的效价却 随着 K2 HPO4 质量浓度的增加而降低 。因此选择 K2 HPO4 的最佳质量浓度是 7 g/ L 。
由试验结果可知 ,在葡萄糖 、糖蜜 、红糖 、蔗糖 4 种碳源中 ,糖蜜对乳链菌肽的效价影响显著 , 为 45010 IU/ mL ,优于蔗糖 ,原因是糖蜜中富含多种糖 分 、天然矿物质及维生素 ,而乳酸链球菌有一个有效 的磷酸转移酶系统作为糖蜜的吸收 、运输及代谢途 径[13 ] 。以下实验均选糖蜜作为乳链菌肽发酵的碳 源 。对糖蜜的最佳质量浓度进行考察 ,试验结果如 图 2 所示 。由图 2 可知 ,糖蜜质量浓度小于 30 g/ L 时 ,随着糖蜜质量浓度的增加 ,乳链菌肽的效价也逐 渐增加 ,糖蜜的质量浓度大于 30 g/ L 时 ,反而对乳 链菌肽的活性产生了抑制作用 ,因此 ,选取糖蜜的最 佳质量浓度是 30 g/ L 。
(1) 选择胰蛋白胨 、玉米浆 、稻糠 、豆饼 (质量浓 度均为 1510 g/ L ) 配制乳链菌肽发酵培养基 ,其他 组分 为 葡 萄 糖 510 g/ L 、K2 HPO4 ·3 H2O 310 g/ L 、 MgSO4·7 H2O 012 g/ L ,确定合适氮源 ,并对其质量 浓度进行优化 。
玉米浆 、糖蜜由长春大成实业有限公司提供 (玉 米浆为液体 ,质量浓度为 1 g/ L) 。 114 培养条件
将菌种接于活化培养基 ,斜面培养 24 h ,再转接 于种子培养基 ,培养温度 30 ℃,摇床转速 140 r/ min 下培养 12 h 。发酵培养条件 : 接种量 5 % ( 体积分 数) , 培养温度 30 ℃, 摇床转速 140 r/ min 下 培 养 24 h 。效 价 检 测 采 用 双 层 琼 脂 扩 散 法 , 参 照 文 献[ 10～11 ] 。 115 试验设计 11511 单因素试验