第八章 双水相萃取技术-2015
《双水相萃取技术》课件
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
第八章 生物产品的萃取和富集
图1 连续错流萃取回收酶的流程图
目的产物的萃取
细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后，与PEG和无机 盐在萃取器中混合，然后进入离心机分相。通过 选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质分配 到上相( PEG相) ，而细胞碎片、核酸、多糖和杂 蛋白等分配到下相(富盐相) 。主要原因有： (1) 核酸和多糖由于其亲水性，易分配到富盐相， 目标蛋白质只有分配到富PEG相才能达到分离目 的。 (2) 下相的高盐浓度易造成蛋白质失活或沉淀，而 PEG对蛋白质有保护作用。 (3) 细胞碎片分配在下相有利于连续式离心机分离， 如在上相易堵塞离心机出口。
第1步萃取后的上相中还含有较多杂蛋白及一些 核酸、多糖和色素(色素因其疏水性分配在上相) 等，可通过加入适量的盐，再次形成PEG/无机盐 体系来进行纯化。目标蛋白质仍留在PEG相中。 在第3步萃取中则将蛋白质转入富盐相，从而将 蛋白质与PEG分离开。但从经济角度考虑，一般 用2步萃取，即在第2步将目标蛋白质转入富盐相。
含水量是反胶团的一个重要参数，决定反胶团物 理性质，决定其大小和每个胶团中所含表面活性 剂的个数。 含水量与表面活性剂的种类、助表面活性剂、水 相中盐的种类和浓度有关。
反胶团体系分类
反胶团制备
相转移法
注射法 溶解法
溶解推动力
A 静电作用： 当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引 力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数 较大,反之,则不能溶解到反胶团相中. B 空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应, 含水率W0 随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小, 空间排 阻作用增大, pro溶解下降.
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间 的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作 用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相 互作用的和。
双水相萃取技术
双水相萃取技术D09生物张燊睿092203112 内容提要:本文主要叙述双水相萃取技术的概念，原理，操作，未来发展方向以及在生物、食品工业中的应用。
Abstract:This paper mainly describes the two aqueous phase extraction technology concept, principle, operation, the future development direction as well as in the biological, food industry application关键词：萃取、分离、双水相体系、提取、生物分离、未来发展、亲和作用。
引言：随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、、代谢工程等高新技术研究工作的广泛的开展，各种高附加值得食品生化新产品不断涌现，对食品、生化等分离技术提出了越来越高的要求。
包括精馏、吸取、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术的三大特点：分离过程伴随有相的变化；筛分过程不能实现分子级别的分离；精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术不相适应。
围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。
双水相系统：基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。
由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。
采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。
当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐（一种是离散盐且另一种是亲液盐）在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成的。
例如用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠杆菌匀浆中提取β-半乳糖苷酶。
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
双水相萃取技术
制作人：马垚 学号：1111021006
目录
双水相萃取技术的原理 双水相萃取技术的特点 双相萃取技术的工艺流程 双水相萃取技术的应用 双水相萃取技术的发展趋势 参考文献
1.双水相萃取技术的原理
1.1 双水相体系的形成机理 双水相体系是指某些有机物之间或有机物与无机 盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成互不相 溶 的 2 相 或 多 相 水 相 体 系 。 从溶液理论上说来，当2种或多种有机物和水溶液 相互混合时，是分层还是混合成一相，取决于混 合时熵变问题和分子间的相互作用力2 个因素。 双水相体系熵的计算很难准确，分子间的相互作 用力也不清楚，因而对于双水相的形成，至今还 没 有 一 套 完 整 的 理 论 模 型 来 解 释 。
在实际单元操作中，由于无法固定整个双 水相体系，也很难确切地知道被分离的原 液含有多少其他物质，这些因素共同作用 和影响，使整个体系变得相当复杂，因而 目前尚没有定量的关联模型能预测整个体 系的分配关系。最佳的操作条件须依靠实 验得到。
双水相形成条件和定量关系常用相图来表示，用 三角形相图或直角坐标相图表示。图1 是典型的 高聚物- 高聚物- 水双水相体系的直角坐标相图， 2种聚合物A、B 以适当比例溶于水就会分别形成 有不同组成、密度的2 相，轻相组成用T 点表示， 重相组成用B 点表示，由图可知上下相所含高聚 物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。C 点 为临界点或褶点。曲线TCB 称为结线，直线TMB 称为系线。结线上方是2 相区，下方为单相区。 所以组成在系线上的点，分为2 相后，其上下相 组成分别为T 和B，T、B 量的多少服从相图的杠 杆定律。即T 和B 相质量之比等于系线上MB 与 MT的线段长度之比。又由于2 相密度相差很小， 故上下相体积之比也近似等于系线上MB 与MT 线 段 长 度 之 比 。
《双水相萃取技术》幻灯片
1956年瑞典Land大学的Albertsson教授及其同事开场 对水相系统研究。测定了许多双水相系统的相图，考察 了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在双水相中的 分配行为，为双水相萃取系统的开展奠定了根底。 只局限于实验内的测定和理论研究。
6)与传统的高聚物双水相相比, 可更好的控制乳化现象。
3.2两水相反响器
在两水相系统中进展转化翻译功能，如酶促反响，可 以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。 这实际上是一种反响和别离耦合的过程，有时也成为萃取 生物转化；如果发生的是一种发酵过程，那么也称为萃取 发酵，因此此时也可以把两水相系统称为两水相反响器。
① 与固定床反响器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反响速度较快，生产能力较高；
② 生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间外表张力低， 轻微搅拌即能姓曾高度分散系统，分散相液滴在10μm 以下，有很大的外表积，有利于底物和产物的传递。
3.5 工业设备
在萃取过程中，要求在萃取设备内两相能密切接触并伴 有较高的湍动，以实现两相之间的质量传递；此后，又能使 两相较快的别离。但是，由于两相间的密度差较小，实现两 相的密切接触和快速别离有一定的困难。
PEG/磷酸钾、PEG/磷酸胺、 PEG/硫酸钠、PEG/葡糖糖等
2.1.3 分配系数 ● 当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后， 由于各种阻碍作用的存在，物质分配不同，使其在上、 下相中的浓度不同。
K=C上/C下
C上和C下分别为被别离物质在上、下相的浓度。
• 分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各物质的K不同 ，可用双水相萃取体系对物质进展别离，其分配情况服从 分配定律。
双水相萃取技术
中草药成分等) 在双水相体系中服从Nernst分配定律:
K = Ct / Cb
其中ct 、cb 分别代表溶质在上相、下相中的浓度。
系统固定时,分配系数为一常数,与溶质的浓度无关。 当目标物质进入双水相体系后,在上相和下相间进行选择 性分配,这种分配关系与常规的萃取分配关系相比,表现出
长素等大分子生物物质的分离与纯化,取得了较好的成效。
近年来,双水相萃取技术的分离对象进一步扩大,已包括了 抗生素、多肽和氨基酸、重金属离子和植物有效成分中的
小分子物质。下表为近年来双水相萃取技术在生物物质分
离的部分应用实例。双水相萃取技术在生物工程分离中已 经显示了良好的应用前景。
EOPO为环氧乙烷（EO）和环氧丙烷（PO）的随机共聚物
表面电荷 当盐的正、负离子对上、下两相有不同的亲和力， 即正负离子的分配系数不同时，就会在相间产生电位， 此电位差的大小为：
U2－ U1=[RT㏑(KB
Z-
÷ KA
Z+
)]/[F(Z+－Z-)]
、 KA
Z+分别表示
其中， U1、U2分别表示相1和相2的电位；Z+、Z-分 别表示一种盐的正、负离子价； KB
一般可获得较大的分配系数，也可调节被分离组分
在两相中的分配系数， 使目标产物有较高的收率；
⑶ 传质速率快,分相时间短。双水相体系中两相的含水 量一般都在80%左右，界面张力远低于水-有机溶剂 两相体系，故传质过程和平衡过程快速； ⑷ 操作条件温和，所需设备简单。整个操作过程在室 温下进行，相分离过程非常温和，分相时间短。大
《双水相萃取技术g》PPT课件
精选ppt
11
1.2.2 疏水作用
PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水 性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点 处的分配系数maa测算
l酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)， 是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设 疏水性最小的甘氨酸的RH＝0。所以上式中 B为
聚丙二醇、聚乙二醇 甲基纤维素
羧甲基纤维素钠盐
磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠 硫酸镁、酒石酸钾钠
精选ppt
5
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
图分别为PEG/葡萄糖(Dx)和精P选EpGpt/磷酸钾(KPi)系统的典型相图 6
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分 成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似 服从杠杆规则，即
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二 醇(polyethylene glycol,略作PEG)/葡聚糖 (dextran，略作Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素 (methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采 用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富 含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合 物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。
双水相萃取技术
1.1 双水相系统 1.2 双水相中的分配平衡 1.3 影响物质分配平衡的因素 1. 4 双水相系统的应用
精选ppt
1
1.1 双水相系统
• 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需 经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的 活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素 特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并 且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采 用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法 可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。
双水相萃取ppt
天然植物药用有效成分的分离与提取
中草药是我国医药宝库中的瑰宝 ,已有数千 年的历史 ,但由于天然植物中所含的化合物 众多 ,特别是中草药有效成分的确定和提取 技术发展缓慢 ,使我国传统中药难以进军国 际市场。因此 ,采用具有较高选择性和专一 性的双水相萃取技术对中草药有效成分的 提取是一项很有意义的工作。利用双水相 萃取中草药有效成分具有代表性的工作是 对黄岑甙和黄岑素的分离。
抗生素的分离与提取
数抗生素都存在于发酵液中 ,提取工艺路线复杂 ,能耗 高 ,提取过程易变性失活。而双水相萃取在抗生素中具 有较大的应用价值 ,萃取提取涉及到各类抗生素。β 内酰胺类抗生素是抗生素家族中应用最多的一类 ,主要 由青霉素类和头孢菌素类构成。对青霉素进行工业化意 义的双水相萃取是结合传统工艺溶媒萃取法进行的。先 以 PEG2000/ (NH4) 2SO4系统将青霉素从发酵液中提取 到 PEG相 ,后用醋酸丁酯(BA)进行反萃 ,再结晶 ,处理 1000ml 青霉素发酵液 ,得青霉素晶体 7. 228g ,纯度 84. 15 % ,三步操作总收率 76. 56 %。
酶工程药物的分离与提取
酶在医药方面的应用一是作为药用酶 ,二是用作化学合 成药物中的酶催化剂。迄今 ,双水相萃取技术已广泛应 用于生物大分子、细胞、细胞器、蛋白质、核酸、病毒、 细菌、蓝藻、叶绿素、线粒体、 菌体等的分离与提取 , 几乎所有的酶均可用此技术仅通过调节 pH、合物和盐的 种类或浓度 ,选择合适的分离条件就可进行理想的分离 纯化。目前双水相萃取技术已成功应用于已较大规模提 取纯化的酶有几十种 。其中成功地实现从微生物细胞碎 片中提取纯化甲酸脱氢酶 ,其分离经 4 次连续萃取 ,已 达处理 50kg 湿细胞规模 ,处理的酶蛋白含量已高达 150g ,收率为 90 %～100 % ,由于工艺简单 ,原材料成 本较低 ,产品的价格也有大幅度降低。
双水相萃取技术
一般来说，双水相萃取时，如果相系统组成位于临界
点附近，则蛋白质等大分子的分配系数接近于1。高
聚物浓度增加，系统组成偏离临界点，蛋白质的分配
系数也偏离1，即K＞1或K＜1 。
盐对带电大分子的分配影响很大。各种盐的分
配系数存在着微小的差异，产生了相间电位。由 于蛋白质等大分子在水溶液中常带有电荷，相间 电位造成的静电力能影响所有带电大分子和带电 细胞粒子在两相中的分配。例如，DNA萃取时，
高聚物（P） 聚丙二醇 聚乙二醇 甲基纤维素 乙基羟乙基纤维素 羟丙基葡聚糖 聚蔗糖 聚乙二醇
高聚物或低聚物（Q） 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石 酸钾钠
温度的影响是间接的，它主要影响相的高 聚物组成，只有当相系统组成位于临界点
附近时，温度对分配系数才具有较明显的
作用。
对酶的分配系数也有很大关系，特别是在系
统中含有磷酸盐时，由于pH的变化会影响
磷酸盐是一氢化物还是二氢化物磷酸盐的存
在，而一氢化物磷酸盐对界面电位有明显的
影响。
Dextran、FiColl、淀粉、纤维素等高聚物具有光学 活性,它们应该可以辨别分子的D、L型。因此，对
从10ml直接放大到1m3规模（105倍）,而各种试验参
数均可按比例放大，产物收率并不降低。
生物化学
细胞生物学 生物化工
食品化工
主要是分离蛋白质 ，酶，病毒，脊髓病毒和线病 毒的纯化，核酸，DNA的分离，干扰素，细胞组 织，抗生素，多糖，色素，抗体等。 目前，用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过 程也达到相当规模，I-Horng Pan等人利用 PEG1500/ NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化β-木糖苷酶，该酶主 要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，纯化倍 数33。
第8章 双水相萃取技术
第8章 双水相萃取技术第 1 页 共 1 页 第8章 双水相萃取技术1 双水相萃取现象：最早是1896年由Beijernek 在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时发现的，这种现象称之为聚合物的“不相溶性”。
70年代中期西德的Kula 和Kroner 等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，大大地改善了胞内酶的提取效果。
双水相萃取技术：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。
利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质进行物质分离的方法称双水相萃取技术，又称水溶液两相分配法。
2 双水相萃取技术基本原理：①双水相的形成—聚合物的不相容性：混合是熵增加的过程，可自发进行。
但是，分子间的相互作用力也会随分子量的增大而增大。
当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于分子量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。
这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。
双水相的形成—系统举例：绝大多数天然的或合成的亲水性聚合物水溶液，在与第二种亲水性聚合物混合，并达到一定浓度时，就会产生两相，两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。
如用等量的1.1％右旋糖酐溶液和0.36％甲基纤维素溶液混合，静止后产生两相，上相中含右旋糖酐0.39％，含甲基纤维素0.65％；而下相含右旋糖酐1.58％，含甲基纤维素0.15％。
聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG ／磷酸钾、PEG ／磷酸铵、PEG ／硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。
PEG ／无机盐系统的上相富含PEG ，下相富含无机盐。
Dextran-PEG 体系的相图：（1）TKB 称为双节线，双节线以下的区域为均相区， 以上的区域为两相区。
（2）TMB 称为系线，是连接双节线上两点的直线，在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。
双水相萃取技术
三、双水相萃取3.1 双水相萃取的原理及特点3.1.1 双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2 双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min；(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题；(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。
在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。
双水相萃取技术
双水相萃取技术（two-aqueous phase extraction）一、前言近年来，随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种高附加值的生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。
与上游过程相比，目前作为下游过程的生化分离纯化技术往往存在步骤多，收得率低，处理时间长，重复性差等缺点，这样便严重阻碍了生物技术的工业化发展。
因此，就迫切需要一种分离步骤少，收得率高，处理时间短，并且易于放大的生化分离纯化技术，双水相萃取技术就满足了这一需要。
特别是基因工程技术的发展，需要从细胞中提取高质量的遗传物质，由于细胞破碎后，在溶液中存在大量的轻质细胞碎片，给遗传物质的提取形成了很大的干扰，通常通过离心分离和溶剂萃取难以得到高纯度高活性的遗传物质，而通过双水相初步提取，可以使目标物和轻质碎片得到很好的分离，且目标物的活性几乎没有损失。
因此双水相萃取技术得到了很大的重视，并且在近20年里取得了较大的发展。
二、发展史双水相萃取技术又称之为水溶液两相分配技术（Partition of two aqueous phase system）1、1896年，Beijernek 在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时，发现这种混合溶液能较快地分为两层，他把这种现象称之为聚合物的“不相容性”（incompatibility）――――体系的发现2、1956年瑞典伦得（Luhd）大学的Albertson发现双水相萃取技术可用于蛋白质的选择分离，但目标蛋白同成相高聚物的分离是影响了其大规模工业应用。
――――――――――发现可以用于分离提纯3、20世纪70年代中期西德的Kula和Kroner等人首先将双水相技术应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，从而大大改善了胞内酶的提取过程，提高了酶的收得率。
―――――――利用于活性物质的提取4、1989年，Diamond等人以Flory－Huggins理论为基础，推导出生物分子在双水相体系中的分配模型，但有局限性，仍需继续探索，不断完善。
双水相萃取课件
双水相萃取的原理
根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但 分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增 大而增大。
当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对
分子质量较大的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位，
即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当
越广泛。
目前，双水相萃取技术已用于多种生物体、生
物组织以及大分子生物物质的分离与纯化，并取
得了较好地成效。
1、双水相萃取常用设备
双水相萃取的基本过程包括双水相的形成、溶 质在双水相中的分配和双水相的分离。 相混合设备 静态混合器是常用的相混合设备。
相分离设备
在双水相系统中，虽然两相较容易达到平衡， 但两相分离则比较困难，这是因为两相的密度差 小，且粘度较大。 达到分配平衡的两相进行分离时，采用重力沉 降法或离心沉降法。一般用离心沉降法。常用的 离心沉降设备有管式离心机和碟片式离心机。
双 水 相 萃 取
主要内容
双水相萃取及萃取的设备工艺流程
1 2 双水相体系的形成 相图 双水相中的分配平衡
3
4 影响双水相分配系数的主要因素
有机溶剂萃取的不足: 1.许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机剂 ；
2.蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定 条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多 相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物 质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务
1）表面自由能的影响（大分子物质表面性质对K 影响很大） 2）表面电荷的影响（盐效应：两相系统中存在如 盐，对K影响很大） 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难 ，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数
第八章 双水相萃取技术
（一）双水相中聚合物组成
1\当两种不同浓度的聚合物与聚合物或者聚合物与 无机盐以不同的浓度混合时，可能存在三种情况：
• a、完全混溶性(匀相溶液)； • b、物理的不相溶性(相分离)； • c、复杂的凝聚(相分离，聚合物聚集在同一相中，
纯溶剂-水聚集在另一相中) • 2\当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷
数和萃取专一性 • （八）易于工艺的连续化生产
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第二节 双水相分配原理及其理论基础
• 一、双水相系统分配原理 • 是否会形成双水相，取决于混合熵增和分子间作
用力两个因素。 • 混合是自发的熵增过程，而分子间相互作用力则
随分子量的变大而增强。 • 当两种高分子聚合物之间互不相溶时，由于相对
分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过 程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的 周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平 衡时，即形成富含两种不同聚合物的两相。
• 成相物质的总浓度越高，系线越长，生物 分子越容易分配于其中的某一相.
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其它因素
• 1.分配物质的分子量 • 2.盐的种类和浓度 • 3.pH值影响 • 4.温度的影响 • 5.通气和搅拌的影响
M×10-4
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第三节 双水相萃取操作及设备
• 一、 双水相系统的选择:易于两相的分离. • • 根据待分离蛋白质和共存杂质的表面疏水
• 曲线把均相区和两相区域 分隔开，称为双结点线。 下区为均相区，上区为两相 区。
• 连接双结点线上两点的直 线叫系线。
• 临界点：当系线长度趋向 于零时，即在图中的K点， 两相差别消失，任何溶质 在两相中的分配系数均为1， 成为单相体系。
PEG
VT BM
VB MT
3.3 双水相萃取技术
双水相萃取技术((Two-aqueous phase extraction,简称ATPS)是指亲水性聚合物 水溶液在一定条件下可以形成双水相,由 于被分离物在两相中分配不同,便可实现 分离。
广泛用于生物化学、细胞生物学和生物 化工等领域的产品分离和提取。
7
2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素钠的水溶液相 混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。
1
例如，生物界已发现的酶有2500种之多， 但仅有100多种酶的工业性分离提取有过 文献报道。
生物工程的产品分离问题，即生物工程 的下游技术的开发是极为重要的。
2
生物物质多是有生理活性的， 常规的分离技术缺点:处理量小、流程长、
易失活、收率低和成本高等。
开发新型的生物物质分离技术，使其适应于 一定的生产规模，且经济简便、快速高效， 是十分迫切的要求。
当体系的组成在图中的曲线上 方时(如M点)，体系就将分为 两相，两相的组成和密度均不 同。
上相(或称轻相)组成用T表示， 主要组成是PEG；下相(或称重 相)组成用B表示，主要组成为 Dextran。
相图中曲线TCB称作结线，直 线TMB称做系线。
十分明显，体系总组成处于系 线TMB上时，分相后的上相和 下相的组成均为T和B。如果体 系的总组成处于结线TCB的下 方，则不满足成相条件，体系 为均一的单相。
两相间所具有的分配系数，来实现分离提纯 的目的。
20世纪70年代，进行了双水相萃取的应用性 研究。
从发酵液中提取各种酶的实验开始的。
5
现在，双水相萃取技术得到了较大的发 展，研究及应用领域:各种酶、核酸细胞、 蛋白质、细胞器和菌体等的分离。
双水相萃取技术是一种具有独特性能、 针对性很强的有前途的分离技术。
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（一）静电作用
• lnK=lnKo+ΔφFZ/RT • Ko为溶质静电荷为零时的分配系数；F为法拉第 常数；Z为溶质的静电荷数；Δφ为相间电位差。 • 荷电解质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成 正比. • 分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异,同一双 水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同 • 带负电荷的蛋白质在双水相种的分配系数K : • K+ < Na+ < NH4+ < Li+ < (C4H9)4N+ • ClO4- < SCN- < I- <Br- < Cl-< CH3CO2- < F- < H2PO4- < HPO42-
（三）成相聚合物的浓度
• 聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的 长度为零,此时分配系数为1，即组分均匀的 分配于上下相. • 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大，系线的长度增加，系统 远离临界点，成相聚合物两相性质的差别 也增大，组分在两相中的分配系数改变。 • 成相物质的总浓度越高，系线越长，生物 分子越容易分配于其中的某一相.
二、双水相萃取工艺设计
• 目标物应满足以下条件： • 与原料液中的杂质应分配在不同的相中 • 在双水相体系中的某一相中的分配系数应 相对较大 • 双水相系统的上下相应易于分离。
工艺流程
• 目的产物的萃取 • PEG的循环 • 无机盐的循环。
（一）目的产物的萃取
• 1.如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则 细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水 相萃取工艺获得较高的纯化倍数。 • 一步双水相萃取是把生物材料悬浮液和双水相系 统混合后，分离上下相，其中下相含有大多数杂 质，而上相再通过超滤操作进行进一步的提纯目 标产物，同时高聚物一相可以得到回收。 • 在两步萃取操作中，把一步萃取体系中的上相分 离出来后，再加入盐使其形成新的双水相体系， 则富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产 物的盐相通过超滤等操作得到分离目标，而且可 以通过浓缩可以进行回收再利用。
三、双水相萃取技术的基本特点
• 两相的性质差别（如密度和折射率等）较小 • 两相间的界面张力也很小
（一）条件温和，体系具有生物亲和性 （二）所需溶液少，操作方便 （三）分离迅速，步骤简便 （四）操作易于控制 （五）可简化分离步骤 （六）能进行萃取性的生物转化 （七）亲和萃取（亲和分配）可大大提高分配系数和 萃取专一性 （八）易于工艺的连续化生产
类型 非离子型聚合物/非离子型聚合物
形成上相的聚合物 聚乙二醇 聚丙二醇
形成下相的聚合物 聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖、聚 乙烯吡咯烷酮 聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、 甲基聚丙二醇、羟丙基葡聚糖、 聚乙烯吡咯烷酮
羟丙基葡聚糖
聚蔗糖 乙基羟基纤维素 甲基纤维素 高分子电解质/非离子型聚合物 高分子电解质/高分子电解质 羧甲基葡聚糖钠盐 葡聚糖硫酸钠 羧甲基葡聚糖钠盐 非离子型聚合物/低分子量化合物 非离子型聚合物/无机盐 葡聚糖 聚乙二醇
一、基本概念及分类
• 双水相系统:某些亲水性高 分子聚合物的水溶液超过一 定浓度后可形成两个不相混 溶的水相。 • 聚合物-聚合物-水系统:聚合 物分子的空间阻碍作用使相 互间无法渗透 。 • 聚合物-无机盐-水系统:盐析 作用。
为什么会形成双水相？
• 聚合物之间的不相容性:聚合物分子的空间阻碍作 用使相互间无法渗透，从而在一定条件下分为两 相。 • 只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合 时就可发生相分离，并且水溶性差别越大，相分 离倾向也就越大。 • 某些聚合物的溶液在与某些无机盐等低分子质量 化合物的溶液相混时，只要浓度达到一定值，也 会产生两相。其形成机理是由于盐析作用。
其它因素
• • • • • 1.分配物质的分子量 2.盐的种类和浓度 3.pH值影响 4.温度的影响 5.通气和搅拌的影响
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第三节 双水相萃取操作及设备
• 一、 双水相系统的选择:易于两相的分离. • • 根据待分离蛋白质和共存杂质的表面疏水 性、分子量、等电点和表面电荷等性质上 的差别，来选择双水相系统，并确定成相 聚合物的分子量及浓度、盐的浓度、pH值 等因素以确定最佳的萃取系统。 •
（二）疏水作用
• 一般情况下，蛋白质的表面均存在疏水区，疏水 区所占比表面越大，其疏水性越强。不同组分由 于其表面疏水性的差异使得其各自在上下相中产 生相应的分配平衡。 • lnKs＝HF(RH +B) • HF为相间的疏水性差，也称疏水性因子；RH为 氨基酸的相对疏水性；B为比例常数。 • lnKo=HF×HFS • HFS蛋白质的表面疏水性.（pH=pI时） • lnK0＝HF(HFS+△HFS) • △HFS为盐浓度增加引起的HFS值增量。 • lnK＝HF(HFS+△HFS)+ ΔφFZ/RT
（四）亲和作用
• 通过一定的方法，将配基连接在双水相的成 相物质分子上，就构成了具有亲和性质的双 水相体系，形成对被分配物质的亲和作用， 调节待提取物在两相中的分配，从而提高其 分离效果 • 过渡金属离子:Cu2＋、Ni2＋、Fe2＋、Zn2＋、 Co2＋等是常用的亲和配基 • 作用机理:配位键力、π-键及静电作用力
三步双水相萃取酶的流程示意图
（二）PEG循环
• 在大规模双水相萃取过程中，成相材料的 回收和循环使用，不仅可以减少废水处理 的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。 • PEG的回收有两种方法： • ①加入盐使目标产物转入富盐相来回收 PEG； • ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂 先洗去PEG，再洗出蛋白质。
（二）成相聚合物分子量
• 同一聚合物的疏水性随分子量的增大而增 大。 • 对于PEG/Dextran所形成的双水相体系中， 若降低PEG相对分子质量，则生物分子分 配于富含PEG的上相中，使分配系数增大； 而降低Dextran相对分子质量，则分配系数 减小。 （质量浓度不变时，亲水基团增多，pro亲水性） • 对于同种聚合物而言，其疏水性随相对分 子质量增加而增加 • 若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于 PEG聚合物，应(?? )它的平均相对分子质 量。
• 对于目标蛋白与杂蛋白的表面疏水性相差 较大的体系，可利用盐析等作用原理，通 过提高成相系统的浓度，增大双水相系统 的疏水性，达到目标蛋白与杂蛋白的分离。 • 对于目标蛋白质与杂蛋白的等电点不同的 体系，添加适当的盐，并通过调节系统的 pH值使相间电位差变大，而达到目标产物 与杂蛋白的分离。
• PEG/Dx系统 • 高聚物/盐体系 • 新的双水相体系:表面活性剂-表面活性剂水体系、双水相胶束体系等体系
四、影响物质分配平衡的因素
• 除了静电作用、疏水作用及界面张力等各 种相互作用因素外，影响物质在双水相系 统中分配的因素主要还有: • 双水相系统的聚合物组成(包括聚合物类型、 平均分子量) • 盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、 pH值) • 溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点) • 体系的温度等。
PEG 质 量 分 数 /%
VT VB
系线
BM MT
两相区
均相区
KPi质量分数/%
• 在同一条系线上的各 点分成的两相具有相 同的组成，但体积比 不同。 • 当上下两相间密度差 小时，两相的体积近 似服从杠杆规则。
VT VB
BM MT
绘制相图实验操作
PEG400 0.700g
H2O 0.5ml (NH4)2SO4 混和 记录 (NH4)2SO4 ml数
（一）双水相中聚合物组成
当两种不同浓度的聚合物与聚合物或者聚合物与无 机盐以不同的浓度混合时，可能存在三种情况： • a、完全混溶性(匀相溶液)；b、物理的不相溶性 (相分离)；c、复杂的凝聚(相分离，聚合物聚集在 同一相中，纯溶剂-水聚集在另一相中) • 当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时， 它们互相吸引并发生复杂的凝聚。 • 不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性 • 水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增： • 葡萄糖硫酸盐<甲基葡萄糖<葡萄糖<羟丙级葡萄 糖<甲基纤维素<聚乙烯醇<聚乙二醇<聚丙三醇。
双水相系统分类
• 双聚合物体系：聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)/葡聚糖（dextran，Dx）； 聚丙二醇（polypropylene glycol）/聚乙 二醇；甲基纤维素（methylcellulose）/葡 聚糖等。 • 聚合物和无机盐体系：PEG/磷酸钾（略作 KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等
H2 O 0.3/0.5ml
混均
旋涡器
浑浊
澄清
按表格重复操作…
绘制相图
PEG400%
(NH4)2SO4%
二、双水相中的分配平衡
• • • • 溶质在双水相中的分配系数也用K=cT/cB表示。 分配系数是各种相互作用的和. lnKP=lnKE+lnKS+lnKA 总分配系数KP: lnKE、lnKS、lnKA分别为静电作 用、疏水作用、亲和作用对溶质分配系数的贡献。 • 在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组 成相同而体积不同的两相，在同一条系线上的不 同点，物质的分配系数相同。
• 上、下相的组成取决于两种聚合物（如 PEG/Dx）的加入量以及其分子质量的大小。 • 当物质进入双水相体系后，由于表面性质、 电荷作用和各种作用力（如憎水键、氢键 和离子键等）的存在和环境的影响，使其 在上、下相中的浓度不同。 • 分配系数 K不同而分离
相图
• 双水相形成条件和定量 关系可用相图表示。 • 双结点线：把均相区和 两相区域分隔开。 • 系线：连接双结点线上 两点的直线。 • 临界点：当系线长度趋 向于零时，即在图中的 K点，两相差别消失， 任何溶质在两相中的分 配系数均为1，成为单 相体系。