病毒基因治疗中有效的载体系统

病毒——基因治疗中有效的载体系统

肖英华　李雅轩　郑继刚(首都师范大学生物系北京100037)

摘要　基因治疗面临的首要问题是如何选择适当的基因载体将具有治疗价值的基因导入靶细胞并使其有效表达,以达到治疗疾病的目的。目前基因治疗临床试验中采用的载体大多数为病毒载体。本文主要介绍基因治疗中常用的4种病毒载体的生物学特性,以及各个载体在基因治疗中的优缺点。

关键词　基因治疗　病毒载体

在基因治疗中,病毒已成为一种有效的载体系统。基因治疗就是将外源基因导入目的细胞并使其有效表达,从而达到治疗疾病的目的。作为当代医学和生物学的一个新的研究领域的基因治疗始于20世纪80年代。直到1990年美国成功地应用基因治疗手段对ADA(腺苷脱氨酶)缺陷病进行治疗,才标志着基因治疗时代的开始。目前,基因治疗已从遗传病扩展到非遗传病领域,例如:传染病,肿瘤,神经系统疾病,免疫缺陷病等。

有效的基因治疗依赖于外源基因在目的细胞中高效、稳定的表达,而这在很大程度上取决于基因治疗采用的载体系统。目前基因治疗中所用的载体可分为两大类:病毒载体和非病毒载体。其中应用最广泛的是病毒载体,约85%的基因治疗临床项目采用的均是这种载体,因其充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性。从理论上讲,各种类型的病毒都可改成为载体,但是由于人们对许多病毒的生活周期,分子生物学认识不够,所以现在只有少数病毒能够改造成为基因治疗所需要的载体。其中反转录病毒,腺病毒,腺相关病毒,单纯疱疹病毒是基因治疗中最常用的4种病毒载体。

1　反转录病毒载体

反转录病毒是一种RNA病毒,基因组大小在8～11kb之间。反转录病毒经寄主细胞表面的受体蛋白识别后进入细胞,然后在自身基因组编码的反转录酶的作用下,以基因组RNA为模板反转录出双链DNA。双链DNA能够随机整合到寄主细胞的染色体上,随着寄主细胞的复制而复制。

从W ei等(1981年)构建第1个反转录病毒载体以来,已相继构建了一系列的载体。尤其在1990年美国成功应用反转录病毒载体进行ADA患儿的基因治疗以来,反转录病毒载体的研究和应用受到了极大的重视。目前临床上运用最多是反转录病毒载体。这种病毒载体大多基于禽类或兽类病毒,现在主要以小鼠白血病病毒(一种肿瘤反转录病毒)为基本骨架构建反转录病毒载体,这种基因载体具有以下优点:1)宿主细胞广泛,能够感染不同生物种类的多种类型细胞;2)能高效的感染分裂细胞,感染率高达100%;3)能使外源基因完全整合到宿主细胞染色体上。但也有明显的不足,主要表现在以下几个方面:1)不能感染非分裂的细胞;2)可能产生具有复制能力的病毒;3)由于是随机整合,可能会引起“插入诱变”;4)包装外源DNA能力有限,小于8kb;5)要求靶细胞表面要具有反转录病毒的相应受体。

慢病毒载体的研究和应用是近几年来反转录病毒载体研究领域的最新研究进展。慢病毒属于反转录病毒的1个亚类,包括各种灵长类病毒(如,H I V21,H I V2 22人类免疫缺陷病毒,S I V2猴免疫缺陷病毒)和非灵长类病毒(如,M VV2羊进行性间质肺炎病毒,F I V2猫免疫缺陷病毒,E I A V2马传染性贫血病毒)。与肿瘤反转录病毒相比,慢病毒有着复杂的基因组,因其基因组中存在核定位信号序列,它能够有效感染并整合到非分裂细胞和最终分化的细胞(除G0期),例如:神经细胞,巨噬细胞,肝细胞,心肌细胞。这些不同类型的细胞作为基因治疗的靶细胞在临床上具有重要价值。慢病毒载体中开发较早研究较多的是以H I V21为基础构建的载体。

2　腺病毒载体

腺病毒为线性双链的DNA病毒,基因组为30～36kb。腺病毒与宿主细胞细胞膜上的特异受体结合经内吞作用进入细胞,其外壳在内粒中降解,其病毒DNA则进入细胞核。在细胞核中腺病毒并不整合到宿主细胞染色体上,而是以染色体外成分存在。腺病毒对上皮细胞,角膜和消化道上皮细胞具有一种天然的嗜向性。腺病毒在自然界分布广泛,在许多哺乳动物和禽类中都发现有存在。自1953年第一次分离到腺病毒以后,至今已分离到100种以上不同血清型的各种腺病毒,其中人的腺病毒有50种以上。与临床疾病相关的腺病毒通常较温和,很少危及生命。

腺病毒载体首次运用到临床,进行的是囊性纤维化病的治疗,即利用腺病毒载体转移囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)基因到患者体内,使其在呼吸道上皮

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细胞内得以表达。至今在临床试验中运用的腺病毒载体主要为第一代腺病毒载体,治疗的疾病包括肿瘤、遗传病、心血管病等。以腺病毒为基础构建基因转移载体具有以下优点:1)人类是腺病毒的天然宿主,所以比较安全;2)该病毒在体外稳定,易于制备与纯化;3)宿主范围广,既可感染分裂细胞,又可感染非分裂细胞;4)可原位感染,特别是肺,可经口服,喷雾,气管内滴注等途径进行治疗;5)外源基因表达水平较高。不足之处在于:1)它几乎可以感染所有的细胞,因此缺乏特异性;

2)因不能整合到宿主染色体上,所以不能持续表达所需产物,表达时间短暂,需重复给予载体制剂治疗;3)因可能刺激免疫反应,使反复治疗的效果会逐渐降低。3　腺相关病毒载体

腺相关病毒为线性单链的DNA病毒,基因组在4.7～6kb之间。它的繁殖依赖于辅助病毒,如腺病毒和疱疹病毒。腺相关病毒的生活周期有两个不同的胞内期:当缺乏辅助病毒时,腺相关病毒感染宿主细胞,其基因组会整合到宿主细胞染色体上,形成潜伏感染状态;当有辅助病毒感染同一个细胞时,腺相关病毒基因组DNA就会复制。从鸟类到许多哺乳动物包括人,体内都分离到各种血清型的腺相关病毒,大多数成人都感染过腺相关病毒,但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。在迄今所见的病毒整合中,腺相关病毒位点特异性整合是仅有的,它能高效整合到人类19号染色体的特定区域。

腺相关病毒的优势在于治疗遗传病(如B型血友病,囊性纤维化病,肌营养不良)和一些目前难以治愈的慢性疾病(如帕金森病、类风湿关节炎、糖尿病、高血压)。以腺相关病毒为基础构建基因转移载体,具有以下优点:1)目前尚未发现该病毒在人体中致病,所以比较安全;2)感染宿主细胞广泛,包括非分裂细胞和分裂细胞,特别是能够感染神经元和神经胶质细胞;3)能特异整合于人的第19号染色体长臂末端,减少了插入突变的可能性;4)外源基因表达稳定,3个月至1.5年。据报道,含Β2半乳糖基因的腺相关病毒载体导入肌肉组织表达可长达2年。但是它难以大量生产,复制需要辅助病毒,并且包装外源基因的能力有限,小于5kb,因此腺相关病毒的利用受到一定限制。

4　单纯疱疹病毒载体

单纯疱疹病毒是一种基因组长约152kb的双链DNA病毒,它进入宿主细胞后,不整合到宿主基因组染色体上。单纯疱疹病毒对非分裂细胞具有天然的亲和力,可感染脊椎动物多种类型细胞,而且对神经系统细胞具有嗜向性,所以这类病毒可利用于将外源基因导入中枢神经系统内,用于帕金森或脑瘤等神经性疾病的治疗。

目前,用作基因转移载体的单纯疱疹病毒主要来源于I型单纯疱疹病毒。以单纯疱疹病毒构建的载体。优点在于:1)宿主范围广,包括大量哺乳动物和鸟类的分裂细胞和非分裂细胞;2)载体易于操作;3)包装外源基因的能力大,可插入长达50kb的外源基因。由于野生型单纯疱疹病毒对人类具有明显的致病性,能够从潜伏状态激活,所以目前仅限于某些恶性肿瘤的临床治疗试验。

在以上4种病毒载体当中,反转录病毒是临床中应用最广泛的载体。除了这4种病毒载体以外,为了更好地满足基因治疗的需要,研究人员还开发了其他的一系列病毒用于基因治疗,例如:痘苗病毒,辛培斯病毒,泡沫病毒,昆虫杆状病毒等。但是病毒用于基因治疗存在着一个潜在的问题,那就是安全性。人们担心在基因治疗的同时,有可能会因病毒的感染而致病。这个问题人们大可放心,基因治疗病毒载体的开发非常严格。如果病毒载体对人体没有百分百的安全性,是不可能被用于基因治疗临床试验的。由于科学家的不懈努力,原有病毒载体会不断得以改进,新的病毒载体也会不断涌现,现在许多病毒载体用于人体治疗是没有危害的,例如:用猫免疫缺陷病毒构建的载体。非病毒载体是基因治疗中应用的另一种载体系统。虽然它近几年来发展迅速,但是由于它起步较晚,技术还不成熟。从目前的角度来看,病毒载体在基因治疗中占有绝对优势,是基因治疗中不可缺少的有效的载体系统。

随着病毒载体这一研究领域的不断深入,人们不难相信基因治疗这一全新的疾病治疗手段将会在很大程度上改变人类疾病治疗的历史进程,治愈人类目前难以治愈的疾病,解除人类的疾病之苦。

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2003年第38卷第11期 生　物　学　通　报