中山大学课件病毒学研究方法分析

病毒空斑
显微镜下的空斑
带有LacZ基因的重组病毒形成的空斑
• 病毒效价的测定（ 多孔板终点稀释法）
– 病毒逐级稀释 – 接入长有细胞的孔中， – 培养后观察各孔中细胞是否被感染， – 计算TCID50 （Tissue Culture 50% Infection Dose ——一半的孔被感染时的稀释度）
– (其中m：病毒感染复数，p(k)：细胞被k个病毒感染的几率) – 所以：未被感染的细胞的比率： p(0)= e-m – 被1个病毒感染的细胞比率：p(1)= e-mm
• 被2个病毒感染的细胞比率：p(2)= e-mm 2 /2
问题： pfu与TCID50 间的换算关系是： 1TCID50 =0.7pfu 为什么？
• SCID：severe combined immunodeficient
• 二、病毒形态学研究方法
– 1、光学显微镜 – 病毒细小，一般光学ຫໍສະໝຸດ Baidu微镜下不可见 – 但有时可见病毒聚集，或衍生形成的包涵体
狂犬病毒包涵体
• 病毒包含体
昆虫杆状病毒的多角体
• 2、电子显微镜
噬菌体负染，透射电镜
疱疹病毒感染细胞的超薄切片，透射电镜
• 病毒效价的测定（之一） 空斑测试 （plaque assay）
– 用稀释的病毒液感染单层细胞， – 盖上琼脂，限制病毒的流动 – 病毒感染造成局部细胞死亡或病变，形成肉眼 可见的“斑”或“空斑”（噬菌体中：噬菌斑） – 根据“斑”的数量和稀释倍数可以统计病毒的 效价
病毒空斑
未感染的细胞被染成红色
接种细胞 60小时
Vero细胞培养
Vero细胞接种PEDV病毒病 变过程照片
ST细胞
接种细胞 24小时
接种细胞 48小时
ST细胞
接种伪狂犬病毒病变过程照 片
Marc-145 细胞
接种细胞 24小时
接种细胞 38小时
接种细胞 50小时
Marc-145 细胞
接种PRRSV病毒病变过程照 片
PK-15 细胞
• 血球凝集试验 • 某些病毒具有与血细胞表面多糖分子结合 的蛋白（基团）。如流感病毒，风疹病毒
• 补体结合试验
– 游离的补体可导致抗体包被的红血球破裂(溶血) – 但当有抗原-抗体复合物存在时，补体就会与抗 原-抗体复合物结合，可避免溶血。 – 由此可检测是否有特定的抗原或抗体存在
• 补体结合试验：测定特定抗原的量
接种细胞 24小时
接种细胞 36小时
接种细胞 48小时
PK-15 细胞
接种TGEV病毒病变过程照片
MDCK 细胞
接种细胞 24小时
接种细胞 48小时
接种细胞 72小时
MDCK 细胞
接种H9N2病毒病变过程照片
• 细胞培养技术在病毒学中的应用
病毒生物学定量 病毒克隆化——获得遗传均一的病毒 方便地生产病毒 同步化研究病毒复制的过程，提高实验的可重复 性
病毒的定量 并非所有的 病毒颗粒都 有感染活性 有感染活性 的病毒颗粒 一般仅占总 数的几 百 到几万分之 一
• 病毒的定量
• 病毒的定量分为： • 物理颗粒的数量 • 有感染活性的颗粒的数量 • 有感染活性的颗粒的数量，更有生物学意义特称为 或Titre)病毒的效价 (Titer Titre
Vero cells growing on Cytodex 1.
Pig kidney cells (IBR-S2) growing on Cytodex 1.
人二倍体细胞培养
接种细胞24小 时
接种细胞72小 时
收毒第3天
• MDCK细胞
Vero细胞培养
接种细胞 24小时
接种细胞 48小时
• 新的电镜技 术 • 冰冻电镜 • 低辐射电镜
冰冻电镜 图像重构 技术
• 冰冻电镜解析病毒结构
一种绿藻病毒的冰冻电镜重构
• 冰冻电镜解析病毒结构
质型多角体病毒冰冻电镜图
• X射线晶体学 • 通过X射线衍射研究病毒中原子、分子的排 列
研究可形成晶体的病毒
• 荧光显微镜
新的荧光显微镜技 术用于实时跟踪 AAV 入侵的过程
• 病毒效价的相对性
– 用不同的细胞株去测定病毒的效价，可能会得 到完全不同的效价数据 – 需要标准化
• 病毒感染复数(Multiplicity of Infection, MOI)
病毒感染复数：病毒感染细胞时平均每个细胞的病毒数
• 1万个细胞，为了保证99%细胞感染病毒，至少有一个病 毒感染，共需要多少病毒？ • 病毒感染细胞是随机的独立事件 • • 群体感染时，有的细胞被1个病毒粒子感染，有的被2个 病毒粒子感染……有的可能没有被病毒感染 • • 病毒感染细胞的情况，符合泊松分布： • p(k)=e-mmk/k!
– 感染复数对病毒感染的实验结果有很大影响低 感染复数时感染不同步 – 高感染复数时病毒易产生变异
• • 不同的实验要求不同的感染复数
• 2、活体培养方法
• 仍有许多病毒缺乏可供其复制的离体细胞培养系统 如：乙肝病毒，大多数植物病毒 • 活体系统还可提供病毒与宿主相互作用的信息免疫 反应 • 致病机理 • 治疗方法
– 最常用活体系统之一：鸡胚
鸡胚用于繁殖病毒、制备疫苗
鸡胚的构造和病毒培养
病毒在鸡胚中的繁殖流感病毒单纯疱疹病
流感病毒
单纯疱疹病毒
• 活体培养方法 • 免疫缺陷动物(SCID 小鼠）对病毒感染无 免疫排斥 • 可接入人的免疫细胞 等，使之具有人的免 疫功能，用于研究 HIV、疱疹病毒等与 免疫系统的相互关系
• 三、免疫学方法
– 病毒学与免疫学是密切相关的
• 免疫技术在病毒学中的应用——利用抗原抗体反应 的专一性进行：病毒的检测 • 病毒的鉴定分型 • 病毒的定量 • 特异性抗体的监测
• 常用免疫学技术
– 血球凝集试验 – 补体结合试验 – 酶联免疫吸附试验（ELISA） – 免疫印迹试验（Western blot） – 免疫荧光组织化学 – 免疫胶体金标记 – 免疫共沉淀
病毒学研究方法
– 病毒培养方法 – 形态学研究方法 – 免疫学(血清学)方法 – 生化、生物物理与分子生物学方法
• 1、体外细胞培养技术
– 二十世纪中期动物细胞体外培养技术的建立， 极大推动了动物病毒学研究的发展
• 原代成纤维细胞 • 建株成纤维细胞 • 上皮细胞
原代成纤维细胞
建株成纤维细胞
上皮细胞