细胞表型实验介绍ppt
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白、药物的机理，是科学研究不可或缺的手段。
2020/2/8
3
1.细胞凋亡、周期
•细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结 束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。依次经过G1-SG2/M，不同时期的细胞内部经历精确的调控，反应相应的机理。研 究细胞周期的变化，有利于了解基因、蛋白、药物对细胞周期产生的 影响，进而指导科研工作。
①
2020/2/8
14
②
③
④
2020/2/8
15
3.细胞侵袭
细胞侵袭:研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭 能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤 细胞，下室加入FBS或实验设定的药物或者影响因子，肿瘤细胞在侵袭 能力较强的情况下，会分泌相关酶类消化基质胶，从而从上室迁移到下 室，通过计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。
BD-Calibur
BD FACSVantage
2020/2/8
5
流式细胞作用机制
鞘液
液
流
Fluorescence signals
系 统
Focused laser beam
喷嘴
2020/2/8
分 析 系 统 光 学 系 统
6
流式细胞仪可检测到的细胞参数
非荧光信号
来自百度文库
颗粒度 细胞大小
前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积。 侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性
细胞感染
克隆形成
细胞固定
克隆计数
细胞染色
2020/2/8
19
5.细胞生长（MTT法）
MTT法原理
MTT比色法：是一种检测细胞存活和生长的方法。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的 蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪490nm波 长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。
22
二维等高图
直方图
报告中常见的几种流式细胞图
2020/2/8
11
细胞周期
流式细胞仪PI染色法检测细胞周期
PI：碘化丙啶
细胞内的DNA和RNA都可以和PI结合,实验前需用RNase将RNA消化后进行检测。
细胞培养
细胞周 期同步
细胞加药
细胞固定
数据分析
流式上机
PI染色
2020/2/8
12
细胞凋亡
Annexin V/PI双染法检测 细胞凋亡
细胞表型实验介绍
2018
2018年8月30日
目录
1. 研究内容目的与意义 2. 实验原理 3. 实验过程 4. 结果分析
2020/2/8
2
细胞表型实验
• 定义：由基因型所产生的细胞的物理表观和可观察到的性质。 • 研究主要内容：细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、趋化、增殖、生长等。 • 细胞表型分析目的意义： 检测细胞的表型，可以帮助了解相关基因、
SDH
MTT
甲
瓒
DMSO
490nm测定OD值
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
2020/2/8
20
• MTT实验 比较转入miR-29c的细胞和空载细胞6d中的增殖能力，各做5个重复。
边缘各孔加200uL PBS液，防止蒸发。
2020/2/8
21
结果记录 结果处理
2020/2/8
2020/2/8
16
Transwell
这是一类有通透性的杯状的装置，杯子底层的一张有通透性的膜， 这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料， 一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
Transwell 小室
2020/2/8
17
• 细胞侵袭 实验实例：孵育24h
ps:磷脂酰丝氨酸 Annexin-V:Ca2+依赖性磷脂 结合蛋白
UL：上左区；一般认为是死亡细胞, UR：上右区；认为是晚期凋亡细胞, LL：下左区； 正常阴性细胞, LR：下右区; 早期凋亡细胞,
2020/2/8
13
2.细胞迁移
• 划痕实验:细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在 体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观 察其对肿瘤细胞迁移的影响。
2020/2/8
18
4.细胞增殖（克隆形成）
单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），其后代所组 成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞， 大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力强弱。 细胞培养环境的改变或药物、基因等外源性因素的作用能导致细胞 克隆形成能力以及细胞集落的大小发生改变。
2020/2/8
7
荧光信号
荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光 染料其发射波长不同。
有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳） 高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）
一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、 FL2、FL3。
•细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的 死亡。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生 物学意义及复杂的分子生物学机制。
2020/2/8
4
流式细胞术
1定义：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性 进行多参数定量分析和分选的新技术。 2.特点 测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞 可进行多参数测量 在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，即分选技术。
2020/2/8
8
荧光信号与细胞特性
荧光染料被激发而发射的光信号。
定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
2020/2/8
9
激光束 侧向散射光， 荧光
细胞
前向散 射光
收集透镜
二色镜
1
2
3
带通滤波片 光电倍增管
2020/2/8
10
流式结果分析
散点图
密度图
2020/2/8
3
1.细胞凋亡、周期
•细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结 束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。依次经过G1-SG2/M，不同时期的细胞内部经历精确的调控，反应相应的机理。研 究细胞周期的变化，有利于了解基因、蛋白、药物对细胞周期产生的 影响，进而指导科研工作。
①
2020/2/8
14
②
③
④
2020/2/8
15
3.细胞侵袭
细胞侵袭:研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭 能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤 细胞，下室加入FBS或实验设定的药物或者影响因子，肿瘤细胞在侵袭 能力较强的情况下，会分泌相关酶类消化基质胶，从而从上室迁移到下 室，通过计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。
BD-Calibur
BD FACSVantage
2020/2/8
5
流式细胞作用机制
鞘液
液
流
Fluorescence signals
系 统
Focused laser beam
喷嘴
2020/2/8
分 析 系 统 光 学 系 统
6
流式细胞仪可检测到的细胞参数
非荧光信号
来自百度文库
颗粒度 细胞大小
前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积。 侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性
细胞感染
克隆形成
细胞固定
克隆计数
细胞染色
2020/2/8
19
5.细胞生长（MTT法）
MTT法原理
MTT比色法：是一种检测细胞存活和生长的方法。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的 蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪490nm波 长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。
22
二维等高图
直方图
报告中常见的几种流式细胞图
2020/2/8
11
细胞周期
流式细胞仪PI染色法检测细胞周期
PI：碘化丙啶
细胞内的DNA和RNA都可以和PI结合,实验前需用RNase将RNA消化后进行检测。
细胞培养
细胞周 期同步
细胞加药
细胞固定
数据分析
流式上机
PI染色
2020/2/8
12
细胞凋亡
Annexin V/PI双染法检测 细胞凋亡
细胞表型实验介绍
2018
2018年8月30日
目录
1. 研究内容目的与意义 2. 实验原理 3. 实验过程 4. 结果分析
2020/2/8
2
细胞表型实验
• 定义：由基因型所产生的细胞的物理表观和可观察到的性质。 • 研究主要内容：细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、趋化、增殖、生长等。 • 细胞表型分析目的意义： 检测细胞的表型，可以帮助了解相关基因、
SDH
MTT
甲
瓒
DMSO
490nm测定OD值
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
2020/2/8
20
• MTT实验 比较转入miR-29c的细胞和空载细胞6d中的增殖能力，各做5个重复。
边缘各孔加200uL PBS液，防止蒸发。
2020/2/8
21
结果记录 结果处理
2020/2/8
2020/2/8
16
Transwell
这是一类有通透性的杯状的装置，杯子底层的一张有通透性的膜， 这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料， 一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
Transwell 小室
2020/2/8
17
• 细胞侵袭 实验实例：孵育24h
ps:磷脂酰丝氨酸 Annexin-V:Ca2+依赖性磷脂 结合蛋白
UL：上左区；一般认为是死亡细胞, UR：上右区；认为是晚期凋亡细胞, LL：下左区； 正常阴性细胞, LR：下右区; 早期凋亡细胞,
2020/2/8
13
2.细胞迁移
• 划痕实验:细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在 体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观 察其对肿瘤细胞迁移的影响。
2020/2/8
18
4.细胞增殖（克隆形成）
单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），其后代所组 成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞， 大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力强弱。 细胞培养环境的改变或药物、基因等外源性因素的作用能导致细胞 克隆形成能力以及细胞集落的大小发生改变。
2020/2/8
7
荧光信号
荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光 染料其发射波长不同。
有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳） 高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）
一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、 FL2、FL3。
•细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的 死亡。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生 物学意义及复杂的分子生物学机制。
2020/2/8
4
流式细胞术
1定义：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性 进行多参数定量分析和分选的新技术。 2.特点 测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞 可进行多参数测量 在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，即分选技术。
2020/2/8
8
荧光信号与细胞特性
荧光染料被激发而发射的光信号。
定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
2020/2/8
9
激光束 侧向散射光， 荧光
细胞
前向散 射光
收集透镜
二色镜
1
2
3
带通滤波片 光电倍增管
2020/2/8
10
流式结果分析
散点图
密度图