实验2-6叶绿素a

抽滤装置（型号：SD）
抽滤时负压不应大于 0.5 个大气压（50kPa） 通过抽滤得到浮 游植物细胞 离心作用
4000r/min 离心机（型号：TG16） 打开门盖→装好转子→加样→关门盖开电 源→按功能键、转子号、转速、时间窗分别 输入设定值→按停止键或时间到时即时停 机→开门盖取样→关电源 恒温水浴锅（型号：HH-S6） 超声细胞破碎仪（型号： BILON88-II） 不要把水浴锅烧干 不要超过破碎容量
2、Chl-a 的提取
将滤膜剪碎，放入具塞离心管，加入 6 mL 热乙醇（75 ℃恒温提取 2 min 后用细胞破碎 仪破碎，超声时间 3 s，间隔 2 s，破碎 5 min 后，用少量上清液清洗细胞破碎仪探头（小于 1 mL） 。将装有提取液的离心管放入离心机，转速 4000 r/min 下离心 10 min，将上清液移入 10 mL 比色管中，再用 2 mL 热乙醇提取液清洗、离心二次取得上清液。最后将提取液定容 到 10 mL。
三、主要试剂的物理常数
名称 乙醇（含水 率 90％）
分子式 C2H6O
分子量 46.07
性状 乙醇是一种无色透明易挥 发有特殊香味的液体，易 溶于水，能以任意比与水 混溶 盐酸是一种无色有腐蚀性 易挥发有刺激性气味的液 体
熔点 -114.3℃
沸点 78．4℃
盐酸 （1mol/L）
HCl
36.46
-114.2℃ （无水）
-85℃ 无水）
四、主要试剂的规格和用量
名称 乙醇 乙醇 盐酸
规格 含水率 90％ 含水率 90％ 1mol/L
用量 10mL 2mL 3滴
在实验中的大致作用 萃取叶绿素 a 清洗 酸化
五、实验需要测定的参数
参数名称 吸光度 乙醇的准确体积 水样的体积 比色皿的长度 单位 Ug/L mL L cm 小数保留位数 小数点后两位 小数点后两位 小数点后两位 小数点后两位 在数据处理中的用途 校正浊度 计算叶绿素 a 的含量 计算叶绿素 a 的含量 计算叶绿素 a 的含量
式中： Ve —乙醇的准确体积，mL；
Vs —水样的体积，L； 1 —比色皿的长度，cm。
恒温作用 破碎细胞使叶绿 素释放出来
七、主要器皿规格及用量
名称 离心分离试管 醋酸纤维滤膜 比色皿 表面皿
规格 10mL 直径 47mm 10*10mm
来自百度文库
用量 6个 4个 2个 2个
在实验中的大致作用 盛装溶液 过滤液体提取浮游植物 细胞 用来装参比液，样品液 放置滤膜
八、实验步骤 1、水样前处理
实验水样由实验室培养的铜绿微囊藻稀释而得，分别取三组浓度水样 50 mL，每组两个 平行样。将水样通过醋酸纤维滤膜抽滤，抽滤时负压不应大于 0.5 个大气压（50 kPa） 。抽滤 完毕后，用镊子小心的取下滤膜，将其对着（有浮游植物样品的一面向里） ，再用普通滤纸 吸压，尽量去除滤膜上的水分；滤膜放置表面皿上冷冻 12 h 以上。
3、Chl-a 含量的测定
用含 90%的乙醇溶液座位空白对分光光度计调零。分别记录在 750 nm 与 665 nm 处各 自的吸光度（分别记为 750 a 和 665 a） ，750 nm 处的测定是用来进行浊度校正的，吸光度应 很低。665 nm 处的吸光度应在 0.1-0.8 单位之间。在比色皿内加入 1 滴 1 mol/L 盐酸使酸化， 混匀 1 min。再记录 750 nm 和 665 nm 处的吸光度（记为 750 b 和 665 b） 。
广西大学环境工程基础实验小组预习报告
实验项目名称： 湖塘水体叶绿素 a 测定
一、实验目的
（1） 初步了解叶绿素 a 测定的原理和常规测定方法。 （2） 通过实验，掌握叶绿素 a 的测定方法及富营养化水样的前处理方法。 （3） 熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。
二、实验原理
浮游植物的主要光合色素是叶绿素（Chlorophyll） ，常见的有叶绿素 a、b 和 c。叶绿素 a（chl-a）存在 于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的 1-2％，是估算浮游植物生物量的重要指标，因此浮游植物叶绿 素 a 含量的测定成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛运用。 浮游植物叶绿素 a 的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液相色谱法（HPLC 法） 、荧光 光度计法和分光光度计法等。其中，分光光度计法成为最常用的浮游植物叶绿素 a 含量的测定方法。 根据所用的色素萃取液分为丙酮法、甲醇法和乙醇法等，再根据比色所用的波长，又分为单色法和多色 法等。主要的细胞破碎法有研磨、低温冷冻、超声破碎等。由于丙酮的萃取效率比较差，甲醇对人体毒害性 大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应用的叶绿素 a 的萃取剂。超声破碎法因快速、 提取效率高等特点也被研究者所青睐。 本实验以热乙醇为萃取溶剂，结合超声细胞破碎法为基础测定叶绿素 a 含量。
六、主要仪器规格及要求
名称 分光光度计（型号：UV-1201） 操作要求 启动应用程序到自检画面，自检前请先将仪 器预热至少 10 分钟光谱扫描。 如果选择 “比 色皿校正”功能，在测量前必须进行比色皿 配对测量。设置好参数后，在参比池和样品 池中都加入参比溶液，盖好样品室盖；按下 “校正”按钮，仪器自动进行校准。校正完 成后即可进行正式的样品测量（使用同一比 色皿时可多次测量而不需重新校正） 在实验中的大致 作用 测定吸光度来对 浊度的校正
九、实验结果处理
通过吸光度的差值来计算对浊度的校正： 665 a-750 a=校正后的 665 a 的吸光度 665 b-750 b=校正后的 665 b 的吸光度 用校正后的 665 a 与 665 b 的吸光度值进行如下的计算：
叶绿素a
29.62 665a - 665b Ve mg/m 3 Vs 1