进修实习生细菌鉴定药敏仪小讲座1

细菌纯分及上机（vitek2 compact系统）一、细菌鉴定和药敏检测流程：初鉴→纯分→选卡→菌悬液配制及稀释→上卡→纯化→结果处理1、初鉴：血液：单瓶报阳（草绿色链球菌、微球菌和阳性杆菌考虑是否为污染菌）多瓶报阳，考虑为致病菌。

无菌体液：主要为胸腹水，脑脊液，关节腔积液有细菌都要处理。

宫颈分泌物: B群链球菌，无乳链球菌CAMP（+）耳鼻喉科分泌物：有正常菌群，流感嗜血杆菌，金葡菌，肺炎链球菌需处理；而奈瑟氏菌，α溶血链球菌等不处理伤口分泌物：骨科和皮肤科采集时，有可能没有进行表皮消毒，培养出凝固酶阴性的葡萄球菌时，需商榷，不一定全部处理。

咽拭子：A群β溶血链球菌，化脓链球菌痰：（+）金葡，β溶血链球菌，肺炎链球菌，纹带棒状杆菌（-）全部阴性杆菌3+，卡他阴性双球菌大量真菌3+2、细菌纯分：目标菌株作鉴定和药敏测试前需传代纯分培养18-24h后（新鲜菌）取单个菌落上机。

3、vitek2 compact系统3.1、工作原理该系统主要由以下几部分组成：样本处理工作站（SCS）、一体化自动装置（最大处理容量为60个试验卡）、精密电子数码比浊仪。

仪器采用单一扫描微量生化鉴定比色法，15分钟连续扫描，与内存曲线斜率比较判断结果。

药敏测定以定量MIC为基础，以MIC分布指纹图谱为分析依据，具有强大的专家软件系统，包括2000多种耐药表型、20000多个MIC分布柱状图和完善的统计分析功能，以及篇参考文献的支持。

3.2、卡片的选择：鉴定卡：GN 革兰阴性杆菌鉴定卡GP 革兰阳性球及部分革兰氏阳性杆菌鉴定卡YST 酵母菌鉴定卡NH 革兰阴性杆菌鉴定卡ANC 革兰阳性杆菌鉴定卡药敏卡：AST-GN13/GN09 革兰阴性杆菌药敏卡/非发酵革兰阴性杆菌药敏卡AST-GP67 革兰阳性球菌药敏卡4、菌悬液配制及稀释:悬浮液为0.45% NaCL液，PH 5.5-7.2菌悬液浓度：鉴定卡GN 0.5 - 0.63MCFGP 0.5 - 0.63 MCFNH 2.7 - 3.3 MCFANC 2.7-3.3 MCFYST 1.8 - 2.2 MCF药敏卡AST-GN 3.0ml 盐水+ 145µl菌悬液AST-GP 3.0ml 盐水+ 280µl菌悬液注意：所有悬浮液开封后有效期为一个月，为避免污染，盐水分装器夜间必须置于冰箱（2℃ - 8℃）。

并每月高温高压消毒一次。

盐水无菌实验检查。

5、上卡：使用前将卡片和盐水瓶从冰箱取出，放室温15-20分钟，充分复温，将卡片按顺序放在载卡架上，输样管插入到菌液管中。

药敏卡应放在配对鉴定卡的后面。

6、纯度实验：用上机后的鉴定卡或者药敏卡的输液管直接在血平板上接种划线，第二天观察所长出的细菌是否为纯菌。

7、结果处理：1）鉴定结果：鉴定卡的结果一般仅给出单一结果，无需进行补充试验，电脑主机VITEK 2 compact程序浏览结果时，可给出结果的可信度评估；如果给出两个及两个以上结果，仪器会做出提示或要求进行补充试验，请按注释进行补充试验，选择正确的鉴定结果；不能鉴定或无法确定的结果，请查找原始分离平板或做纯度实验的平板，确认所分离细菌是否为纯培养，必要时重新分离并重新进行鉴定试验。

2）药敏结果：如果同时进行鉴定和药敏试验，细菌鉴定结果会自动加到药敏卡上；否则需手工添加细菌名称到药敏卡信息中；如果有专家系统评语出现，则应按操作规程对药敏结果作适当的修改并确认最终结果。

注：仪器检测几种状态-鉴定或药敏实验正在进行中-需进行补充实验-操作者确认分离株信息，并点击review-结果处理完成二、vitek2 compact仪简介生物梅里埃生产的vitek系统，第一代vitek系统包括（vitek-AMS32、60、120、240），第二代vitek2 compact。

采用八进位制数码鉴定及动态鉴定的原理，每个用于鉴定的测试卡内有30项反应，每3个反应为一组，将各组反应结果相加，30项反应可得一组10位数的数码。

由计算机控制的读数器，每间隔一定时间对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化，获得当时的待检细菌的生化反应谱和生物编码，当生长对照孔透光度到达终点阈值时，则指示此卡已完成反应，系统以此时各孔的反应值作为判断依据，组成数码并与数据库中标准菌的生物模型相比较，获得相似系统鉴定值，得出鉴定结果。

动态鉴定是利用细菌最佳时间段生物特征作为鉴定依据，所以会比传统鉴定时间短，报告速度更加快捷。

第二代与第一代分析仪的差别：1）速度更快，每一卡由60min读数一次改为每15min读数一次。

2）自动化程度更高，不需手工写号，自动废弃完成的卡片。

3）含PK/PD的高级专家系统，使药敏结果更符合体内疗效。

4）根据细菌生长速度，有4种不同药敏分析软件，更快速报告药敏结果，避免假敏感。

三、vitek2 compact系统（V2C）细菌鉴定的要求及影响因素：1、鉴定细菌包括范围：G+c(GP)、G-b(GN)、酵母样真菌（YST）、嗜血杆菌和奈瑟氏菌属（NH）、G+b和厌氧菌（ANC）、革兰阳性芽孢杆菌（BCL），共可鉴定细菌400余种。

2、平均在2h、3h、15h可完成常见革兰阳性、革兰阴性和酵母样菌的鉴定。

3、细菌浊度仪测定原理：用于测定的浊度的试管是由特殊的聚苯乙烯材料制作而成，发光二极管发出的光源，经过滤光膜成为590nm波长的发射光，590nm 波长的光线透过接种菌液，由公式计算获得OD值，并自动换算为麦氏单位（MCF），测定浊度范围在0～7.5MCF。

4、比浊仪的质控：实验室应配备校正标准管，在标准管上标有标准的浊度，在每日使用前先测试浊度仪能否正确判读标准管的MCF值，判读值差异不应大于规定值范围，当浊度仪在控时方可用于正式测试。

5、鉴定细菌对接种物的浊度要求：GP、GN卡菌悬液浓度应在0.5～0.63MCF，YST卡1.8～2.2MCF，ANC、NH卡2.7～3.3MCF。

6、用于鉴定的细菌对分离的培养基要求：GP卡可选择哥伦比亚血琼脂、胰酶大豆琼脂等；GN卡可选择哥伦比亚血琼脂、胰酶大豆琼脂、麦康凯琼脂；YST 卡可选择沙保罗、真菌显色培养基。

一些含抑制剂成分的分离培养基中的某些成分能影响细菌生化物征的表达，如SS、加万古霉素的巧克力平板。

四、vitek2 compact系统（V2C）药敏试验和专家系统：1、如何测试超广谱β内酰胺酶（ESBL）：采用3对底物进行测试，分别是头孢吡肟/头孢吡肟+克拉维酸、头孢噻肟/头孢噻肟+克拉维酸、头孢他啶/头孢他啶+克拉维酸，含克拉维酸反应孔MIC值比单抗生素反应孔下降3倍以上，可确认该细菌产ESBL。

2、如何测试MRSA：针对金黄色葡萄球菌，采用对头孢西丁和苯唑西林的检测，其任一为阳性，都确定为MRSA。

3、测试药敏的细菌范围：G-菌包括肠杆菌科、非发酵菌、不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌；G+菌包括葡萄球菌、肠球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌；酵母样真菌药敏卡正在研究中。

4、专家系统的特点：专家系统是一个高级电脑软件，其功能是用于对系统报告的药敏结果进行审核，防止错误药敏结果误导临床用药，应用药代动力学的原理全面评价药敏结果，使与体内疗效更接近，及时发现新的耐药机制。

5、专家系统审核药敏结果基本步骤：1）生物学认证—审核药敏结果中表型和MIC结果是否符合当前已知细菌的耐药谱。

2）治疗应用的解释—根据全球公认的药敏试验指南对天然耐药药物的结果作出校正。

3）启动耐药规则—报告细菌对不同类抗菌药物的耐药机制。

4）抗生素推导—根据交叉耐药、协同耐药原则提示某一抗生素结果可推导哪些药物的药敏结果。

5）对治疗用药提出建议—结合PK/PD因素及细菌对药物的耐药性，推荐用药方案。

五、质控操作程序1、质控目的：监测试验所用试剂和仪器的精密度和准确度；监测试验所用试剂和仪器的质量；监测进行试验的工作人员是否规范操作。

2、反应卡质控：鉴定卡药敏卡GN AST-GN13AST-GN09GP AST-GP673、用于质控标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞ATCC27853，粪肠球菌ATCC29212, 产酸克雷伯菌ATCC.嗜麦芽窄食单胞菌鉴定卡标准菌株药敏卡标准菌株GN ATCC AST-GN13 ATCC25922ATCC GN09 ATCC27853GP ATCC29213 AST-GP67 ATCC29213ATCC292124、质控菌株的贮存1) 质控菌株储存于-75℃超低温冰箱内。

2) 在测试前应将菌株在血琼脂板上移种以获得单个菌落。

3) 按前述菌悬液制备方法，将菌株制成悬液以进行试验。

4) 只要MIC值没有发生由于方法错误造成的有意义的改变，质控培养物就可以一直用于监测试验的精密度和准确度。

如果某意外结果提示该菌株的内在敏感性发生改变就应换用此质控的新培养物。

5、质控频率（每月第一周进行质控）1）质控频率可分为每日质控，每周质控和每月质控,先进行每日质控（连续20次）如果结果满意（20次中，不能连续2次超过允许范围）后转为周质控。

如果连续3周质控满意，则转为每月质控。

2）如出现大的难以纠正的失控，查找到原因后，要连续实施每日质控，每周质控以观察质控的稳定性，如果连续20天每日质控满意（20次中不能连续2次超过允许范围），连续3周每周质控满意，则又转为每月质控。

6、新生产批号反应卡的质控操作对于每一批新生产批号反应卡取一张，应用相应质控菌株检测生化反应和MIC 值以保证卡片的可靠性。

7、失控处理：如质控结果和目标反应结果出现误差，必须查误、矫正。

明显错误：1) 错误使用质控标准菌株；2) 菌株/悬浮液（0.45%盐水）污染；3) 悬浮液的浓度未在要求的范围。

建议采用梅里埃提供的悬浮液；4) 没有按照标准操作程序操作。

如无明显错误，开始以下查误步骤1) 重复实验以认证误差结果；2) 重新采用“质控”程序；3) 确认比浊仪功能正常，用校正管重新进行校正；4) 所有试剂未过有效期，并妥善保存。

5) 孵育/判读箱温度正常。

6) 标准菌株未受污染，生物特性及没有改变。

7) 菌悬液浓度符合实验要求。

8) 妥善转种，传代标准菌株于建议的平板上。

9) 转种的标准菌株孵育时间符合建议时间。

8、仪器维护和保养：分为日维护、月维护和必要时维护1）日维护：在仪器界面上按“！”依次浏览系统错误信息；表面清洁；检查及必要时倾倒废弃的检测卡片。

2）月维护：清洁废卡槽；清洁填充仓；清洁光学读头；清洁孵育转盘。

3）必要时维护：清洁载卡架，取下条形码；剩余船体用10％漂白液清洗并浸泡5分钟，风干；装回条形码。