产气荚膜梭菌检验作业指导书
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1 目的
规定矿泉水产气荚膜梭菌的检验方法，保证按标准化操作。
2 适用范围
适用于产气荚膜梭菌检测。
3 术语
产气荚膜梭菌：是继沙门氏菌、葡萄球菌后引起食物中毒的又一重要的病原菌。属于革兰氏阳性粗大梭菌，芽孢呈卵圆形，肉汤培养时芽孢少见，须在无糖培养基中才能生成芽孢。无鞭毛，不运动，属于专性厌氧菌。
4 职责
操作步骤
6.3.1推测性检验
6.3.1.1水样过滤：在100级的洁净工作台进行过滤操作。
6.3.1.2用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将50mL水样或稀释液通过孔径μm的滤膜过滤。
6.3.1.3将过滤后的滤膜贴在已制备好的SPS琼脂平板（截留面朝上），然后倒置于36±1℃厌氧培养装置培养24h。
质检员负责按作业指导书进行检验。
5 流程图
无
6 作业内容
检验方法原理
微孔滤膜是一种微孔径的过滤膜（通常孔径为μm、μm，滤膜直径为47mm），滤膜能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上的典型微生物菌落数，算出一定体积水样中含有的微生物菌落总数。
6.3.3.4牛奶发酵试验
取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛奶培养基，在46℃水浴中培养2h后观察有无“暴烈发酵”现象发生，在5h内不发酵者为阴性，产气荚膜梭菌能发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。
6.3.4结果报告
根据黑色菌落的计数和确证性试验为阳性的结果，计算每50mL水样中的产气荚膜梭菌数量，结果以CFU/50mL计。
实验器材、培养基及试剂
6.2.1实验器材
不锈钢过滤器装置、滤膜（直径47mm，微孔径μm）、抽滤设备、无齿镊子、显微镜（10×～100×）、量筒、培养皿、灭菌锥形瓶、恒温培养箱（36±1℃）、恒温水浴锅（46±1℃）、酒精灯、冰箱（0～8℃）、厌氧培养装置、超净工作台。
6.2.2培养基及试剂
庖肉培养基、庖肉牛肉粒、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）、液体硫乙醇酸盐培养基（FT）、动力硝酸盐培养基（A法）、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、1g/L蛋白胨水、硝酸盐还原试剂（甲）、(乙)液、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂配套试剂、革兰氏染色液
6.3.1.4平铺时应避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。
6.3.2计数
产气荚膜梭菌菌落在滤膜上呈现大小不等的黑色菌落。
将可疑菌落进行革兰氏染色、显微镜检查等确认性试验，产气荚膜梭菌应为革兰氏阳性粗大杆菌。
计数每50mL水样中的产气荚膜梭菌菌落数。
6.3.3确证性试验
6.3.3.1接种
将SPS琼脂平板上生长的可疑黑色菌落接种于FT培养基，36±1℃培养18～24h，然后进行下列试验。
6.3.3.2革兰氏染色
革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热菌株可能形成卵形芽孢，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。
6.3.3.3动力硝酸盐试验
穿刺接种动力硝酸盐培养基，于36±1℃厌氧培养24h，观察接种线的生长情况，判断有无动力。滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各1～2滴，观察硝酸盐是否被还原。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。若培养基变为红色，则为动力硝酸盐阳性反应。
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适用于产气荚膜梭菌检测。
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产气荚膜梭菌：是继沙门氏菌、葡萄球菌后引起食物中毒的又一重要的病原菌。属于革兰氏阳性粗大梭菌，芽孢呈卵圆形，肉汤培养时芽孢少见，须在无糖培养基中才能生成芽孢。无鞭毛，不运动，属于专性厌氧菌。
4 职责
操作步骤
6.3.1推测性检验
6.3.1.1水样过滤：在100级的洁净工作台进行过滤操作。
6.3.1.2用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将50mL水样或稀释液通过孔径μm的滤膜过滤。
6.3.1.3将过滤后的滤膜贴在已制备好的SPS琼脂平板（截留面朝上），然后倒置于36±1℃厌氧培养装置培养24h。
质检员负责按作业指导书进行检验。
5 流程图
无
6 作业内容
检验方法原理
微孔滤膜是一种微孔径的过滤膜（通常孔径为μm、μm，滤膜直径为47mm），滤膜能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上的典型微生物菌落数，算出一定体积水样中含有的微生物菌落总数。
6.3.3.4牛奶发酵试验
取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛奶培养基，在46℃水浴中培养2h后观察有无“暴烈发酵”现象发生，在5h内不发酵者为阴性，产气荚膜梭菌能发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。
6.3.4结果报告
根据黑色菌落的计数和确证性试验为阳性的结果，计算每50mL水样中的产气荚膜梭菌数量，结果以CFU/50mL计。
实验器材、培养基及试剂
6.2.1实验器材
不锈钢过滤器装置、滤膜（直径47mm，微孔径μm）、抽滤设备、无齿镊子、显微镜（10×～100×）、量筒、培养皿、灭菌锥形瓶、恒温培养箱（36±1℃）、恒温水浴锅（46±1℃）、酒精灯、冰箱（0～8℃）、厌氧培养装置、超净工作台。
6.2.2培养基及试剂
庖肉培养基、庖肉牛肉粒、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）、液体硫乙醇酸盐培养基（FT）、动力硝酸盐培养基（A法）、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、1g/L蛋白胨水、硝酸盐还原试剂（甲）、(乙)液、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂配套试剂、革兰氏染色液
6.3.1.4平铺时应避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。
6.3.2计数
产气荚膜梭菌菌落在滤膜上呈现大小不等的黑色菌落。
将可疑菌落进行革兰氏染色、显微镜检查等确认性试验，产气荚膜梭菌应为革兰氏阳性粗大杆菌。
计数每50mL水样中的产气荚膜梭菌菌落数。
6.3.3确证性试验
6.3.3.1接种
将SPS琼脂平板上生长的可疑黑色菌落接种于FT培养基，36±1℃培养18～24h，然后进行下列试验。
6.3.3.2革兰氏染色
革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热菌株可能形成卵形芽孢，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。
6.3.3.3动力硝酸盐试验
穿刺接种动力硝酸盐培养基，于36±1℃厌氧培养24h，观察接种线的生长情况，判断有无动力。滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各1～2滴，观察硝酸盐是否被还原。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。若培养基变为红色，则为动力硝酸盐阳性反应。
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