液相色谱柱的使用与维护

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使用保护柱的结果
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色谱柱的保存
使用厂商推荐的溶剂保存色谱柱（COA） 除去杂质、缓冲盐，缓冲液残留在色谱柱内，将促使细菌生长，使色谱柱或 筛板堵塞，或导致鬼峰的出现 为防止金属腐蚀，应避免用含卤素溶剂保存色谱柱 色谱柱不能保存在容易发生降解的溶剂中如THF（四氢呋喃），TFA（三氟 乙酸），TEA（三乙胺）等 避免色谱柱床变干
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色谱柱的安装
HPLC柱，粒径5um，内径4.6mm时：
UPLC柱，1.7或1.8um，内径2.1mm时： （UPLC柱体积小，更容易发生溶剂挥发柱床 干涸的问题）??
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测试色谱柱的柱效
不测试柱效的“后果”：
0.009"
注：过长的管线亦会造成较大的谱带展宽
0.040" 0.020"
样品谱带在管线内发生了扩散
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色谱柱安装及连接的机械因素-连接
连接适当
连接不妥，造成漏液
连接不妥
谱带展宽
由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽，机械问题
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柱效下降
柱性能下降的一个重要现象就是在保留时间基本不发生变化的情况下， 色谱峰的区域宽度明显增大(如下图)。
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柱效下降
具体现象 可能原因 解决办法 更换内径更小、长度更短的 连接管；将连接管与色谱柱 连接紧密；更换体积较小的 流通池 (对于细径柱) 无法恢复 用同型填料填补，柱效可部 分恢复 用强洗脱溶剂清洗或更换筛 板；挖出污染填料，更换洁 净填料 备注 为使色谱柱具有 较高柱效，应对 管路连接严格把
塔板数是反映色谱柱
以及仪器性能状态的关键参数 相同色谱柱
A 12,000
B 7,000
ຫໍສະໝຸດ Baidu
仪器A ： 谱带展宽较小（70µL） 测出的塔板数较高（12,000）
仪器B ： 谱带展宽较大（130µL） 测出的塔板数较低（7,000）
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柱外谱带展宽的机械因素
柱外死体积大 色谱峰 区域展宽 色谱柱受震荡，填料出现间隙 填料被流动相溶蚀而流失，入 口柱床层塌陷 色谱峰 区域展宽 (伴随色谱 峰拖尾) 色谱峰 区域展宽 (伴随色谱 峰前延)
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关，确保死体积
较小；为使色谱 柱在尽量长的时 间内保持较高柱 性能，流动相的 纯度和过滤一定
_保留时间改变
_峰型问题
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目录
正确使用
_柱效测试 _色谱柱的平衡 _色谱柱的清洗 _色谱柱的保护 _色谱柱的保存
色谱柱常见故障
_柱效下降 _基线问题
_保留时间改变
_峰型问题
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了解你的色谱柱：
色谱柱维护使用指南书(网站下载)
梯度洗脱时，为了梯度性能最佳以及重现性最好，我们建议添加剂或 缓冲盐应同时加入水相溶剂瓶和有机相溶剂瓶内，保持梯度过程中添加 剂或缓冲盐浓度不变。
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在您开始之前:
关于柱平衡与洗针溶剂
仪器洗针溶剂
– 强洗针溶剂： 9:1 water: acetonitrile – 弱洗针溶剂/purge溶剂：初始梯度的流动相条件 [但不包含盐、添加剂或缓冲盐]
Weakest
Acetone
Primary [Weak] Solvents
Acetonitrile
Isopropanol Ethanol
Elution [Strong] Solvents
Methanol Water
Strongest
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Use a less polar solvent to Increase retention of polar analytes
缓冲液（盐）的浓度
用色谱纯溶剂，并与填料相匹配
溶剂中的杂质含量
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色谱柱平衡/反相色谱柱
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离子对试剂的使用
使用离子对流动相的色谱柱
– 明显需要较长的平衡时间 – 因为，一般在一根色谱柱中： 1µ mol/m2 表面覆盖率 300 m2/g 硅胶表面积 2g 色谱柱中的填料量
填装良好的色谱柱在系统、连接状况皆良好的状况下，色谱 峰形很好
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色谱柱的安装
色谱柱可能已经发生：
– 溶剂部分挥发，柱床部分干涸 – 常用C18柱发生干涸时：如果操作正确，可将柱恢复至应有柱效
好的操作习惯：
– 仅连接柱入口端、纯有机溶剂、低流速：检查是否存在柱干涸情况 – 如存在柱干涸：充分排除柱内气泡，避免进入检测器 – 如存在柱干涸：继续用纯有机溶剂、低流速浸润柱，避免柱压骤升
在您开始之前: 样品溶剂的影响
样品溶剂会强烈影响溶解性与峰形（就像反相一样） 样品溶剂最少含75%乙腈，或尽可能的与初始流动相条件相近 但极性分析物通常在有机溶剂中存在溶解性不佳的问题，常可使用的 HILIC样品溶剂溶解策略是：
– 75:25 乙腈:甲醇对大多数极性分析物奏效 – 在溶解性问题和色谱峰形问题之间寻找折中方案 – 根据您的样品性质来调节pH值促使样品溶解（如：添加0.2%甲酸提高碱性分 析物的溶解性，或添加氨水提高酸性分析物的溶解性）
影响柱效的系统因素：
（摘自SunFire维护使用说明书）
- 系统死体积，包括系统中过长 冗余的管路、或管路内径过大 不合适，等等；
- 不合适的管路与柱的连接； - 检测器采样频率过低。
（摘自ACQUITY UPLC维护使用说明书）
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新柱柱效测定结果 系统对柱效的影响
– Silica, amino, diol
流动相含有高比例的有机溶剂 (> 80%) 和少量的水相
– 水（或其它极性溶剂）是强的洗脱溶剂
*Alpert, A. J. J.Chromatogr. 499 (1990) 177-196.
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溶剂选择性与洗脱强度
新拿到一根色谱柱开始实验前，要先测试柱效
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正确使用色谱柱-总述
样品方面 了解样品在流动相中的溶解度，用流动相试样品的溶解度，防止其在流动相 中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用 流动相方面 过滤
脱气
纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值必须在填料的允许范围内
缓冲盐
– 配制一份储存用溶液 [通常可为 200 mM] 然后在使用时用运行的流动相将其 稀释20倍即可 [10 mM 柱上浓度]
– 例如: 配制好一份 200 mM 甲酸铵, pH 3. 要配制含有 90% 乙腈和 10% 水 和 10 mM 甲酸铵 pH 3的流动相时，加入50 mL储存缓冲盐高浓度溶液，50mL水 和 900 mL乙腈即得。
色谱柱的保存
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HILIC介绍
HILIC – 亲水作用色谱(Hydrophilic Interaction Chromatography)
– 1990 提出，以区别于正相色谱*
HILIC 是正相色谱的一个“变种”，它避免了使用与水不相容的有机溶剂， 流动相中含有水 – “反反相色谱”，又称“水相正相色谱” 固定相是极性填料
覆盖此色谱柱需要相当于600µ moles的离子对试剂，如果流动相中PIC试剂的浓度 是每升1mM，就需要600ml溶剂 在1ml/min流速下，需要600分钟（10小时）
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色谱柱清洗和再生
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Waters HILIC 模式色谱柱
Hybrid HILIC Column (pH range extended)
ACQUITY UPLC® BEH Amide XBridgeTM Amide (HPLC) (pH 2-11)
ACQUITY UPLC® BEH HILIC XBridgeTM HILIC (HPLC) (pH 1-9)
Silica HILIC Columns (pH range 1 – 5)
Atlantis® HILIC Silica (HPLC only)
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在您开始之前: 流动相的配制
添加剂
– 直接用液态添加剂替代 0.2%的流动相体积 [2 mL out of 1 L]
液相色谱柱的使用与维护
Waters CBU Marketing 王欣玲 Xinling_wang@waters.com
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目录
正确使用
_柱效测试 _色谱柱的平衡 _色谱柱的清洗 _色谱柱的保护 _色谱柱的保存
色谱柱常见故障
_柱效下降 _基线问题
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色谱柱的保护
使用保护柱和在线过滤器 经常清洗色谱柱 对脏样品进行预处理，最大限度减少强保留组分和颗粒 按照色谱柱生产商的温度上限指标之下操作色谱柱 在压力范围内使用色谱柱 按标注方向操作色谱柱 询问色谱柱生产商确定色谱柱是否可以反冲 使用新鲜溶剂，防止细菌生长 色谱柱使用完毕后，应将盐和缓冲液冲洗干净，并用乙腈保存色谱柱
防止水中细菌生长
注意存放的温度 避免机械震动
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目录
正确使用
_柱效测试 _色谱柱的平衡 _色谱柱的清洗 _色谱柱的保护 _色谱柱的保存
色谱柱常见故障 _柱效下降
_基线问题 _保留时间改变 _峰型问题
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进样体积 进样器（密封垫问题） 连接管线，特别是：
– 进样器至色谱柱 – 色谱柱至检测器
}
注意：谱带最早由进样器产生
注意：这是最常见的问题
接头及筛板 检测器的检测池体积 色谱柱本身
– 色谱柱内的死体积 – 筛板阻塞
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实例：管线内径对柱效的影响 —
测试柱效
一、了解色谱柱之前的情况并判断色谱柱是否正常 二、将检测结果小心保存，当实验过程中发现异常时，再检测柱效进行对比，来 进一步排查原因 三、按照色谱柱检测报告方法测试色谱柱，由于色谱系统有差异，您的测试结果 可能与色谱柱厂家实验室得到的结果有所差异， 可归因于仪器的不同 四、理论塔板数可使用下面的公式估算： N=3500L/dp L 代表柱长，单位是 cm；dp 代表填料粒径，单位是 µ m。 一般来说，变化小于20%
全新的色谱柱时
– 用50倍空柱体积的 50:50 acetonitrile:water 含10 mM 缓冲盐或0.2% 添加剂
柱平衡
– 用流动相初始条件对色谱柱进行平衡20倍空柱体积
梯度运行之间
– 用5-8倍空柱体积的流动相初始条件进行平衡
与任何色谱柱一样，平衡不足则会导致保留时间漂移
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- 如柱效不佳，将浪费对实际样 品的分析测试时间、问题排查 时间，甚至宝贵样品；
- 对于新柱，如柱效不佳，难以 判断是否是样品或流动相污染 所造成；
- 建议新柱在到货后，即进行柱 效测试，如有疑问，及时与供应 商联系排查。
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影响色谱柱柱效表达的系统因素
在色谱柱与进样器之间使用不同内径的管线
上图是用0.009″内径的管路连接时测 柱效的色谱图：
柱效：1,1000
下图是用0.04″内径的管路连接时测 柱效的色谱图： 柱效：4000
注：使用相同色谱柱
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实例：管线内径对柱效的影响
连接管线的内径对系统谱带展宽的影响