细菌感染的分子生物学检验ppt课件

第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验
结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核 病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生 生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度 大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐 药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困 及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫 情死灰复燃。 据WHO统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝 杆菌，在某些发展中国家成年人中群中结核分枝 杆菌携带率高达80%，其中的5%~10%携带者可 发展为活动性结核病。
TB H37Rv 基因组中共有3924个开放阅读框，其 中91%有潜在的编码能力，ORF中最常见的起始 密码子61%为ATG，35%为GTG。
187个ORF参与脂类代谢、细胞壁合成， 360个参与细胞壁代谢， 66个参与脂类合成， 287个参与能量代谢， 95个参与氨基酸合成， 38个与细菌毒力相关， 69个参与DNA合成。
一、细菌感染的一般性检出策略
细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就是以感 染病原体的特异核酸序列作为检测目标序列，利用分 子生物学技术对目标序列进行检测，从而直接判断有 无细菌感染和是何种病原体感染。 二、细菌感染的完整性检出策略 完整性检出策略，即不仅对病原体作出快速准确诊断， 还需要对其进行分型（包括亚型）和耐药性等方面的 检测，尽可能地为临床诊疗提供更为详尽的细菌病原 体的相关信息。
TB具有合成所有必需氨基酸、维生素和酶辅助因 子的潜在能力。该菌具有代谢各种各样碳水化合 物、乙醇、酮和羧酸的能力。此外，还具有许多 涉及脂代谢、糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸和 乙醛酸循环所必须的酶分子。 TB的培养特点：馋、懒、丑。 馋--营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、 甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基（罗氏） 上才能生长良好。 懒--生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基 上2～5w才出现肉眼可见的菌落。 丑--典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透 明，乳白色或淡黄色，如菜花样。
所编码的蛋白约有40%的为功能性蛋白，44%的 与已知蛋白有相似性信息，16%的则为未知蛋白。 TB不同菌株之间存在多个差异基因。 基因组中有3个毒力因子：mce、过氧化氢酶-过 氧化物酶和sigA。除了这些单基因毒力因子，细 菌的胞壁也对致病性起着重要的作用。
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二、结核分枝杆菌的分子生物学检验内容 （一）结核分枝杆菌核酸的检测
目前结核杆菌常规检测方法
痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。 培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌 生长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。 血清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广 泛的交叉，特异性不强。
一、结核分枝杆菌的基因组结构特征
TB H37Rv 全基因组为环状双链 DNA，长约4 411 529bp，共有 4000基因， G+C平均值65.6%， 其基因序列高度保守。 H37Rv 基因组中有50 个编码功能 RNA 的基因，其中 45 个 tRNA基 因，3 个 rRNA 基因和 2 个核稳定 （stable）RNA基因，这些 RNA 分子是由特异的核糖体RNA 操纵 子产生的。 在H37Rv 全基因组中有16个拷贝的IS6110插入序列和6个 拷贝的IS1018，大多数插入序列位于基因间或非编码区， 通常靠近tRNA基因聚集成串，插入序列在染色体中主要分 布在重复区。
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细菌感染的分子生物学检验
细菌感染是致病菌或条件致病菌入侵机体，并在机体 中生长繁殖，产生毒素或其他代谢产物所引起的全身 性感染，临床上以寒战、高热、关节疼痛等为特征， 部分患者还可以出现烦躁、四肢厥冷、发绀、呼吸加 速、血压下降、感染性休克等临床症状。 传统上对于细菌感染的病原体检测主要采用免疫学、 微生物学和血液学等相关技术，但这些技术方法受灵 敏度和特异性的限制，不易达到早期诊断。 利用分子生物学技术检验感染性病原体自身遗传物质 （RNA或DNA），从而达到早期、快速、敏感、特异 地检测已经成为临床检验的主流技术之一。
第一节 细菌感染的分子生物学检验策略
分子生物学检验是以核酸（DNA或RNA）或蛋 白质分子为检验目标，通过检查人体内源基因 或外源（病原体）基因的存在、缺陷或表达异 常，对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法 和过程。
机体感染细菌后，应用分子生物学技术直接测 定这些细菌病原体基因，不仅可以对微生物感 染作出明确诊断，同时也能诊断出带菌者或潜 在性感染，还可以对感染性病原体进行分型和 耐药性监测。
结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得 治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有 高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组 中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包 括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多 药物外排泵系统。
抵抗力特点：“三耐四敏” ※耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000） ※对湿热、70％乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长 期使用易产生耐药性） 变异性 ※典型形态→多形性 ※ R型菌落→S型菌落 ※有毒→无毒（用于制备疫苗） ※抗结核药敏感→耐药
TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁 除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖 脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚 集成团，用抗酸性染色被染成红色。
对养要培求特殊条件，一 般要经4-6周才出现肉眼可 见的菌落。TB通过呼吸道、 消化道和破损的皮肤粘膜 侵入机体，它被吞噬后能 在吞噬细胞内繁殖，导致 巨噬细胞裂解，还可在细 胞外繁殖。
可采用PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、线性探针杂 交、链替代扩增技术、扩增结核分枝杆菌直接试验、基 因芯片技术、全自动结核检测平台等方法检测标本中的 TB DNA。 1、 PCR PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、 MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色 体DNA的重复序列等。常规PCR的不足：产物的交叉污 染、假阳性、假阴性、实验室污染。 2、real-time PCR 与传统PCR相比，具有敏感度、特 异性高及方便快速等优点，特别是对难以培养与生长缓 慢的结核杆菌的检测更有优势。