天然产物紫杉醇的分离及其纯化19页PPT
紫杉醇的提取及分离纯化 - studysyaueducn
紫杉醇的提取及分离纯化
制作人：曲晓林 符烊宁 解说员：曲晓林
1 固定化细胞培养 植物细胞有细胞壁和大的液泡，对剪切力十分敏感， 易受机械损伤。固定化细胞培养技术是在可控条件 下使植物悬浮培养的细胞聚集成团并且限制在特定 空间和表面上，使这些细胞团在不损失生物量的同 时能连续不断地分泌次生代谢物质。固定化的方法 主要有吸附在载体上，包埋在多孔凝胶珠或微胶囊 中。目前这一技术应用中遇到的难题是次生代谢产 物释放的问题，因为大部分次生代谢产物都储存在 液泡内，对其自身的积累起着负反馈作用，使固定 化培养不能连续操作。另外，长时间的固定化培养 也易使细胞受污染。
2.高产菌株的筛选 • 解决植物细胞培养生产次生代谢物产量低 的有效的手段之一是筛选高产细胞株系。
高产细胞系的筛选有很多不同的方法，如
选择含量高的外植体，单细胞克隆法，原
生质体培养法、小细胞团法、抗性筛选法
及负筛选法等。
3.高产细胞系的建立及种质保存
• 将适量愈伤组织团转移到装有50ml液体培养基的150ml三角瓶中，置旋 转式摇床上进行悬浮培养，摇床转速160r*min-1离心5min，收集单细 胞及小细胞团，转移到新鲜培养基中进行继代培养，即可以得到悬浮 培养的无性细胞系。 • 根据实验结果表明，生长旺盛的红豆杉基本上不启动次生代谢，只有 当细胞群体处于对数生长后期，细胞的增殖基本停止，细胞有一定程 度的分化后才开始合成和累积紫杉醇。针对红豆杉细胞生长和紫杉醇 合成的特点，必须设计有针对性“两步培养法”以获得最佳产量。即 第一步采用利于细胞生长增殖的生长培养基，以在最短的时间内得到 最大的生物量，然后更换成有利于目标产物合成的生产培养基进行第 二步培养，以得到最高的紫杉醇产量。
《紫杉醇的生物合成》课件
02
紫杉醇生物合成途径
前体物质的合成
葡萄糖磷酸化
葡萄糖在己糖激酶的催化下磷酸化生成6-磷酸葡萄糖。
磷酸戊糖途径
6-磷酸葡萄糖在磷酸戊糖异构酶的作用下生成5-磷酸核酮糖，再经过一系列反 应生成5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖。
紫杉二烯的合成
甲羟戊酸途径：5-磷酸木酮糖在酮糖 基转移酶的催化下生成4-丙二醇焦磷 酸，再经过一系列反应生成法呢烯焦 磷酸，最后生成牻牛儿基牻牛儿酯。
紫杉二烯合成酶
负责将前体物质转化为紫杉二烯，是紫杉醇生物合成的关键酶之一。
基因克隆与鉴定
通过基因克隆和鉴定，了解紫杉二烯合成酶的结构和功能，为人工合成紫杉醇提 供理论依据。
紫杉醇合成酶与基因
紫杉醇合成酶
负责将紫杉二烯进一步转化为紫杉醇，是紫杉醇生物合成的最后一步。
酶活性调节
研究紫杉醇合成酶的活性调节机制，探索如何提高紫杉醇的产量。
牻牛儿基牻牛儿酯在细胞色素P450酶 系的作用下生成紫杉二烯。
紫杉醇的合成
01
紫杉二烯在细胞色素P450酶系的 作用下生成5α-柯巴基焦磷酸，再 经过一系列反应生成巴卡亭Ⅲ。
02
巴卡亭Ⅲ在巴卡亭酶的作用下生 成巴卡亭Ⅳ，再经过一系列反应 生成紫杉醇。
紫杉醇的修饰与转运
紫杉醇在细胞色素P450酶系的作用下经过氧化、还原、水解等反应生成多种具有抗癌活性的代谢产 物。
代谢工程
对微生物的代谢网络进行改造，优化紫杉醇的合成途径。
利用合成生物学技术构建紫杉醇生产菌株
构建基因编辑工具
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对紫杉醇生产菌株的精 准编辑。
构建高产菌株
通过基因工程技术，将紫杉醇合成相关基因导入到高产菌株中，构 建出具有高生产能力的紫杉醇生产菌株。
紫杉醇的分离与纯化
摘要目的：探索红豆杉中紫杉醇的提取纯化工艺。
方法：将新鲜的红豆杉树皮干燥后用甲醇浸泡，陶瓷膜进行固液分离，纳滤膜浓缩，再用大孔树脂HZ818层析，洗脱液浓缩结晶，再活性炭脱色后甲醇重结晶，再硅胶正向层析，洗脱液浓缩后正已烷结晶，再真空干燥得成品。
结论：按本方法从红豆杉中提取的紫杉醇纯度为97.5%，收率为十万分之八。
关键词红豆杉，紫杉醇，提取纯化，树脂，硅胶目录一、紫杉醇目前的一些分离纯化方法。
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（一）液相萃取。
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（二）固相萃取法。
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（三）树脂层析法。
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（四）活性炭脱色。
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（五）硅胶正向层析。
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（六）结晶纯化。
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抗癌药物紫杉醇的天然提取与分离技术
反渗透又称逆渗透，一种以 压力差为推动力，从溶液中 分离出溶剂的膜分离操作。 对膜一侧的料液施加压力， 当压力超过它的渗透压时， 溶剂会逆着自然渗透的方向 作反向渗透。从而在膜的低 压侧得到透过的溶剂，即渗 透液；高压侧得到浓缩的溶 液，即浓缩液。
早期的色谱纯化紫杉醇工艺是采用多根硅胶层析 柱串联的一种操作，但是因为硅胶对紫杉醇的不 可逆吸附造成了巨大的损失，使得紫杉醇的回收 率很低，仅为0.004%左右。近年来，随着色谱技 术的进步，不断有新的色谱技术被引入到紫杉醇 的分离提取过程中来。除了高速液相色谱法 （HPLC，其中包括正相-HPLC、反相-HPLC）外， 还有薄层色谱法（TLC）、胶束电动毛细管色谱法 （MECC）和高速逆流色谱法（HSCCC）等。
经实验后的HPLC色谱分析可 以看出SFE法可以高效的分离 出紫杉醇，且效率高于传统的 使用各种有机溶剂的提取方法， 具有高效，周期短，废渣无残 留，能最大程度保证各组分原 有活性，不产生三废，绿色环 保等诸多优点。
实 验 结 果
江苏无锡有中国 最大的紫杉醇培 植基地 人工培植的紫杉醇幼苗
下面以复旦大学的实验设备为例，讲解CO2超临界流体萃取的原理及其设备。
CO2和修饰剂分别由CO2泵和修饰剂泵 打入各泵的锥形腔体中，再经流体混合 其按设定的比例混合后，流入萃取器中 的集流腔。在达到萃取设定的温度和压 力后，萃取器开始萃取。动态萃取时， 超临界CO2流体经限流管流入甲醇收集 瓶后减压排放，流体带出的萃取所得物 则溶于收集液中。
超滤膜，是一种Leabharlann 径规格一致， 额定孔径范围为0.001-0.02微米的 微孔过滤膜。在膜的一侧施以适 当压力，就能筛出小于孔径的溶 质分子，以分离分子量大于500道 尔顿、粒径大于2～20纳米的颗粒。 超滤膜是最早开发的高分子分离 膜之一，在60年代超滤装臵就实 现了工业化。
紫杉醇的分离与纯化
摘要目的：探索红豆杉中紫杉醇的提取纯化工艺。
方法：将新鲜的红豆杉树皮干燥后用甲醇浸泡，陶瓷膜进行固液分离，纳滤膜浓缩，再用大孔树脂HZ818层析，洗脱液浓缩结晶，再活性炭脱色后甲醇重结晶，再硅胶正向层析，洗脱液浓缩后正已烷结晶，再真空干燥得成品。
结论：按本方法从红豆杉中提取的紫杉醇纯度为97.5%，收率为十万分之八。
关键词红豆杉，紫杉醇，提取纯化，树脂，硅胶目录一、紫杉醇目前的一些分离纯化方法。
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（一）液相萃取。
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（二）固相萃取法。
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（三）树脂层析法。
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（四）活性炭脱色。
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（五）硅胶正向层析。
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（六）结晶纯化。
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紫杉醇及其衍生物的研究ppt课件
紫杉醇的改造及其衍生物
三尖杉宁碱( cephalomannine,2) [3]和紫杉醇结构十分相似, 仅在侧链部分有 细微的区别, 且其在红豆杉中的含量仅次于紫杉醇。以三尖杉宁碱为原料, 通 过对其侧链双键的催化氢化及环氧化反应, 分别得到两对非对映异构体, 制备 HPLC分离得到四个化合物, 通过NMR及CD谱确定化合物的立体结构, MTT实验 表明四个化合物对某些肿瘤细胞株的抑制活性优于紫杉醇。合成化合物的稳 定微管活性研究正在进行中。
紫杉醇及其衍生物的研究来自目录1、红豆杉介绍 2、紫杉醇的研究 3、紫杉醇开发途径和合成方式 4、紫杉醇的改造和衍生物 5、对紫杉醇的展望
红豆杉属植物是一类古老的植物类群，全世界有11种，分布于 北半球的温带至热带地区。除澳洲的Austrotaxus Spicata一种产 于南半球之外，其余红豆杉均产于北半球。从红豆杉的地域分 布上看，美国、加拿大、法国、印度、缅甸和中国等地都有分 布，但属亚洲的储量最大，其中，中国境内的红豆杉就占全球 储量的一半以上。中国有4种1变种，黑龙江省只有东北红豆杉1 种，天然分布很少。不过东北红豆杉主要分布在吉林省长白山 和黑龙江一带，辽宁东部山区也有少量分布。其分布特点是： 分布区域狭窄，面积小，并呈间断分布，散生在其它群落中， 天然更新少，在绥阳林业局紫杉分布相对较密的林地约3600公 顷，主要分布在寒葱河、青山、三岔河、细鳞河等林场。云南 红豆杉主要分布在 滇西与地州16个县总面积约9万平方公里， 其特点是分布广， 生长分散，无纯林，多为林中散生木。南方 红豆杉主要分布在滇东、滇西南、滇东纯林，多为林中散生木。 湖南省邵阳市绥宁县朝仪乡老湾村、永州市双牌县阳明山绞车 庙村、安徽省黄山市黄山区等地分布大量天然红豆杉。
紫杉醇的改造及其衍生物
紫杉醇ppt课件
味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机 溶剂。
3
药理作用
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• 新型抗微管药物,通过促进微管蛋白聚合抑 制解聚,保持微管蛋白稳定,抑制细胞有丝 分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放 射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗 敏感的G2和M期。
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静脉输注时注意事项
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• 监测患者心脏有无传导异常、心动过 缓,监测重要的生命体征,特别是在输 注的第1h内。
• 观察患者有无过敏反应, 如呼吸困难 、低血压、胸痛等。
• 观察患者有无胃肠道反应,如恶心、呕 吐、腹泻等
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静脉输注时注意事项
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• 观察注射部位反应, 输注过程中出现 外渗可导致水肿、疼痛、红斑和硬结, 偶尔会发生蜂窝组织炎,也可发生皮肤 变色反应,对外渗反应目前尚无特异治 疗方法。
六个月内复发的乳腺癌患者。 • 非小细胞肺癌患者的一线治疗。
• AIDS相关性的卡氏肉瘤的二线治疗。
5
禁忌症
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• 紫杉醇过敏的患者。 • 基础中性粒细胞小于1.5x10^9/L的实
体瘤患者。 • 对聚氧乙基-35-蓖麻油或用其配制的
药物（如环孢霉素浓缩液和替尼泊苷 浓缩注射液）
6
不良反应
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药物配制
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• 输液器使用的影响: 由于一次性注射器和 输液器多为聚氯乙烯材质,而紫杉醇注射液 中的成分EL会引起增塑剂二基己肽酸化物 从聚氯乙烯滴注袋中漏出引起肝毒性。因 此,应选用玻璃容器和玻璃注射器存放和抽 取药液,使用特制的带有滤过装置的输液器 ,过滤器的微孔膜直径不超过0.22μm,以防 止紫杉醇溶液中的细小微粒进入体内, 从 而降低过敏反应发生率。
紫杉醇的分离工艺
⒉紫杉醇的分离工艺红豆杉针叶、树皮、根的采集原料的干燥及研磨初级萃取次级萃取水相（含键合相）有机相色谱纯化纯品紫杉醇图11-4紫杉醇分离纯化工艺紫杉醇的分离纯化工作开展较早，最早的分离巩义市1966年采用400根试管的逆流分配色谱法，从12g太平洋红豆杉树皮中提取了少量紫杉醇，历时两年，这种工艺十分琐碎，收率极低。
随着相关科学技术的不断发展，分离工艺也获得了很大的改进。
一般来说，紫杉醇的分离工艺可以分为粗提和纯化两个阶段，分离纯化过程可用图11-4表示。
⒊紫杉醇粗提工艺粗提阶段的目的在于从原料液中尽可能多的提取目标产物，所得到的物料在进行后续的提纯直至获得纯品。
粗提过程中初级萃取和次级萃取所采用的溶剂不同可以导致除去杂质不同，不同时期研究者对这两个过程的研究结果列于表11-5中。
目前用于提取紫杉醇的最普遍的初级萃取剂是乙醇（甲醇）和水，采用95:5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间35～60min；采用纯甲醇，所需萃取时间则为16～48h。
在大多数情况下还需对甲醇初级萃取物进行次级萃取。
一般是在初级萃取物中加入二氯甲烷和水的混合物，即液-液萃取，该方法可以有效地除去萃取液中50％（质量比）的非紫杉醇烷类物质。
如果采用一个较为复杂的分离体系，发现所有的紫杉醇都在氯仿相中。
次级萃取除了可采用各种有机溶剂进行液-液萃取外，还可以采用固相浸取法和超临界流体萃取法。
这两种方法的共同特点是有机溶剂用量少，减少了环境的污染。
若用枝叶为原料，由于枝叶特别是枝叶中含有许多色素和蜡质，无疑将大大增加紫杉醇的提取分离难度。
这要求首先在甲醇粗提取物中加入低极性溶剂如正已烷以除去此物质，该法可除去红豆杉枝叶中多达72%的可溶于正已烷的杂质。
五、正相色谱过程为核心的紫杉醇分离纯化工艺正相色谱是紫杉醇分离纯化工艺中普遍采用的方法，在早期紫杉醇分离纯化的研究中占有主导地位，至今仍在广泛应用。
在紫杉醇分离纯化过程中，正相色谱的突出优点是固定相价格廉价，用普通的硅胶即可，而且洗脱用流动相多为挥发性很强的有机溶剂，溶剂回收简单、能耗低。
《紫杉醇有机全合成》PPT课件
• 目前已有研究表明该药具有良好的放疗增 敏作用，这个浓度远低于细胞毒性作用所 需要的水平。多烯紫杉醇通过诱导肿瘤细 胞发生G2/M期阻滞和促进细胞凋亡来实现 其增敏作用，而射线作用于肿瘤细胞后最 终也使细胞发生凋亡 。
• 1992年12月美国 FDA正式批准紫杉醇用 于治疗转移性卵巢癌，后又批准用于转移 性乳腺癌。100公斤紫杉醇大约能治疗5万 多个肿瘤病人，现在国际市场上1公斤紫杉 醇的最低价格是26.5万美元。
• 从自然资源中提取药物，造福患者，本是 件治病救人的好事，但如何在药物开发和 保护自然资源之间寻求平衡，这是我们今 天必须面对的现实问题。
• 完全从生物中提取是远远不够的，而且破坏 生态环境，这要求我们必须经过另外的一条 道路。
什么道路呢
？
现今可以选择的道路：
1.生物合成
2.利用紫杉树的细枝、叶等可再生材料， 提取初级原料，再人工半合成生产紫杉醇
制备CD环体系(化合物22)是通过Wieland— Mischer酮(化合物21)为起始物完成的，化合物21 作为较易得到手性化合物决定了以后反应产物以及 最终产物紫杉醇的立体构型。化合物22与含A环 的化合物23连接得到含A—CD环的化合物24。化 合物24再利用分子内的Heck反应环合成B环从 而得到含ABCD环的化合物25，再通过进一步的氧 化等反应得到化合物26，26最终通过适当的氧化等 反应转化为Baccatin III(2)和紫杉醇(1)。在最后 引入侧链时也采用了ojima coupling反应(图6)。
紫杉醇的来源
• 紫杉又名红豆杉、赤柏松， 为紫杉科紫杉属长绿针叶 乔木，是世界珍稀濒危物 种，国家一级保护植物。 因其药用价值巨大，世界 各国将其列为“国宝”， 素有“植物黄金”之称。 目前在我国共有4个种和1 个变种，即云南红豆杉、 西藏红豆杉、东北红豆杉、 中国红豆杉和南方红豆杉 （变种）。但在我国资源 并不丰富。
制药工艺学：紫杉醇生产工艺ppt课件
美国斯坦弗大学Paul A．Wender教授领导的小
组研究的紫杉醇全合成路线 ，墙 类似 Holton路线，采用了直线合成战略，即由含A 环化合物合成含AB环化合物，然后构建含ABC 环化合物，最后完成ABCD环的合成。
整理版课件
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将天然产物蒎烯(pinene)的氧化物verhenon(化合 物27)为起始原料，化合物27含有A环结构且可提供 紫杉醇母核骨架中20个碳中的1O个碳原子。经过若 干步反应将27转化为化合物31，再将化合物31转化 为化合物32，完成了AB环的构建。然后通过在C．3 位上设计的反应以及氧化反应得到化合物34、35， 进一步通过醇醛缩合得到化合物36、37，这样就完 成了c环的构建。再通过C．5位溴代、c4和C-20臭 氧化完成了含氧D环的构建(化合物38)，最后得到了 Baccatin III(2)，再完成C．10乙酰化及与侧链的 加成反应等，最终完成整理了版课紫件杉醇的全合成(图7) 31
verhenon
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五、 Kuwajima全合成路线 (1998)
日本东京科技研究院Isao Kuwajima教授领导 的紫杉醇全合成研究小组采用了A+c—Ac—ABc —ABcD的会聚法合成路线 ∞ ，其类似于Nico— laou法和Danishefsky法。由
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紫杉醇生产工艺
概述
6.1.2 紫杉醇的生产工艺路线研究 ？
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红豆杉与紫杉醇-原料来源问题
1)天然提取工艺路线
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解决办法（一）
– 人工栽培
采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法 快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗
– 寻找红豆衫的替代物