三黄片质量标准起草说明

组别:
组员:
【名称】三黄
片黄片质量标准起草说明三黄片质量标准起草说明
大黄300g 盐酸小檗碱5g 黄苓浸膏21g 见正文，按制成1000粒。

本品为糖包衣或薄膜包衣，除去包衣后显棕色；味微苦、涩
(1) 盐酸小檗碱的TLC 鉴别 盐酸小檗碱为该药的主要成分，参照 2010版
《中
国药典》黄柏的TLC 鉴别方法，以盐酸小檗碱为对照品(购自中国药品生物制品 检定所)，用薄层微量进样器分别吸取盐酸小檗碱标准品配制成的对照品溶液和 供试品溶液各2ul,用薄层电动点样器分别点同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的 硅胶G 薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10 : 7： 1 : 1)为展开剂,展 开,取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。

此外，令使用苯-醋酸乙酯-甲 醇-异丙醇-浓氨试液(12 : 6 : 3 : 3 : 1)为展开剂进行验证，置用氨气预饱 和15mi n 的展开缸内。

展开，取出，晾干，紫外光灯(365nm)下检视，供试品色 谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同的一个黄色荧光斑点。

阴性对照色谱在 与对照品色谱相应的位置上无斑点。

(2) 大黄的TLC 鉴别：大黄为本方的君药，所含的大黄酸、大黄素、大黄酚是主 要有效成分，参照2010版《中国药典》大黄的TLC 鉴别方法，以大黄素对照品、 大黄酸对照品、大黄酚对照品及大黄对照药材(购自中国药品生物制品检定所) 吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液及对照药材溶液各 10卩L ,对照品溶液5卩
L ,
分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚(30〜60 C )-甲酸乙酯-甲酸(15 : 5 : 1) 的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

此外以石油醚 (30〜60 C )-甲酸乙酯-乙酸(15 : 4 ： 1.5)的上层溶液为展开剂进行验证，展开， 取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

供试品色谱中在与对照药材色谱相应 的位置上，显相同5个橙黄色荧光斑点，在与对照品色谱相应的位置上显相同橙黄 色斑点，置氨气中熏后，日光下检视,斑点为红色。

阴性对照色谱在与对照品色谱相 应的位置上无斑点。

(3) 黄苓的TLC 鉴别：黄苓为本方的臣药，其含有的黄苓苷，汉黄苓素，黄苓 素为主要成分，参照2010版《中国药典》黄苓的TLC 鉴别方法，以黄苓苷对照 品、黄苓素对照品、汉黄苓素对照品及黄苓对照药材 (购自中国药品生物制品检 定所)吸取上述溶液各5卩L ,分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮- 甲酸-水(5 : 3 : 1 ： 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5 %三氯化铁乙醇液。

另 以醋酸乙酯一丁酮一甲酸一水(5 : 3: 1: 1)为展开剂验证，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁乙醇液。

结果供试品色谱在与 对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。

结果供试品色谱在与对照品色谱相 应的位置上，显相同颜色斑点。

阴性对照色谱在与对照品色谱相应的位置上无斑 点。

【检查】
重量差异： 取供试品20片，除去糖衣，得到的片芯应检查重量差异并符合 规定，精密称定总重量，求得平均片重后，再分别精密称定每片的重量，每片重 量与标示片重相比较(无标示片重的片剂，与平均片重比较) ，按表中的规定， 超出重量差异限度的不得多于2片，并不得有1片超出限度1倍。

【处方】 【制法】 【性
I
查法采用升降式崩解仪检查。

崩解时限的考察 ^号 水分 甲醇 乙醇
【含量测定】黄苓苷、大黄素、大黄酚以及盐酸小檗碱是本方的主要成分，按照 2010版《中国药典》黄苓、大黄、黄柏药材的定量检查。

盐酸小檗碱的定量检查： 1仪器与试药
DIONE 高效液相色谱仪，包括Ultimate 3000四元低压梯度泵，UltiMate 3000 二极管阵列检测器，Chromeleon 色谱工作站；日本岛津AEU-21（电子天平；HS-2060 型超声波清洗器（天津恒奥科技有限公司）；盐酸小檗碱对照品（中国药品生物 制品检定所，批号：110713-200208）;三黄片；甲醇为色谱纯；水为已滤纯化 水；其它试剂均为分析纯。

2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：DIONEX-C18（25O nmX 4.6 nm ， 5卩m ；流动相：乙腈 -0.05 mol/L 磷酸二氢钾水溶液（52 : 48,每100 mL 含0.1 g 十二烷基磺酸钠）； 流速：1.0 mL/min ；检测波长：354 nm 进样量：20卩L ;柱温：30E 。

在此色 谱条件下，样品中盐酸小檗碱色谱峰与其他组分色谱峰可达基线分离， 且与其他 相邻色谱峰分离度>1.5 ;理论板数按盐酸小檗碱色谱峰计算 >2000。

2.2供试品溶液的制备
2.2.1 • 1提取方法考察：供试品溶液制备精密量取三黄片 1g ，置25 mL 量瓶中， 用甲醇溶解并稀释至刻度，超声处理10 min ，静置1 h ，上清液用0.45卩m 微孔 滤膜滤过，取续滤液，即得。

提取方法 超声 索氏
2.2.1.2提取时间考察 ________________________________________________ 提取时间（h ） 面积1 面积2 面积3 盐酸小檗碱的含量（ mg/g ）
0.5 1 1.5 _____________________________________________________________ 2.2.1.3提取溶剂考察 提取溶剂 水
甲醇 乙醇
崩解时限
面积1面积2 面积3 盐酸小檗碱的含量（mg/g ） 面积1面积2 面积3 盐酸小檗碱的含量（mg/g ）
2.2.2阴性对照溶液的制备按照三黄片处方，依制备工艺制备成缺盐酸小檗碱的 阴性对照品，按供“ 2.2.1 ”法制成阴性对照溶液。

2.2.3对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品 6.2 mg ，置25 mL 棕色量瓶 中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得 248卩g • mL-1盐酸小檗碱对照品
溶液。

2.3系统试应性试验精密吸取对照品、供试品及阴性对照2.4线性关系考察精密 吸取盐酸小檗碱对照品储备液 0.25 , 0.5，1.0，2.0，
3.0，6.0 mL ,置10 mL 量 瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

分别取上述不同浓度的盐酸小檗碱对照品溶液 20卩L ,注入液相色谱仪，测定峰面积，以盐酸小檗碱浓度为横坐标，盐酸小檗
碱色谱峰面积为纵坐标，计算得线性回归方程为：Y=9.8516C+1.5232, r=0.9995 ; 盐酸小檗碱线性范围为：6.2-148.8卩g/mLo 2.3.1提取溶剂考察
进样量（ug ）__2 4 6 8__10 峰面积 甲醇 乙醇
2.9样品含量测定分别精密量取3批三黄片1g ，按“2.2.1 ”项方法制备供试品溶 液，注入高效液相色谱仪，按“ 2.1项”色谱条件进样测定峰面积，由外标法计 算盐酸小檗碱含量。

（见表2）
表2样品含量测定结果（n=3）
大黄素和大黄酚含量测定
1. 材料和仪器
1.1 仪器：高效液相色谱仪；TG-332精密分析天平（上海天平仪器厂）；超
2.5精密度试验取盐酸小檗碱对照品溶液，重复进样 6次，每次20卩L ,测定峰 面积，结果盐酸小檗碱峰面积的RSD %0.46%,表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验取同一供试品溶液于室温放置，分别在 0、1、2、4、& 12 h 进 样测定，结果盐酸小檗碱峰面积的RSD % 1.68%o 表明处理后的供试品溶液在12 h 内保持稳定。

2.7重现性试验取同一批号三黄片样品6份，按“2.2.1 ”项方法制备供试品溶液， 各吸取20卩L ,按“ 2.1项”色谱条件进样测定，测得样品中盐酸小檗碱含量为 0.13 mg/mL , RSD 为 1.02%。

2.8加样回收率试验精密量取同一批号已知含量的三黄片样品 6份（盐酸小檗碱 含量为0.1326 mg/mL ,每份2.5 mL ,精密加入盐酸小檗碱对照品适量，按
“ 2.2.1 ” 项方法制备供试品溶液，依“ 2.1项”色谱条件进样20卩L 测定，记录峰面积， 计算盐酸小檗碱含量与回收率。

（见表1） 表1加样回收率试验结果（n=6） 供试品 加入量
率 RSD
（mg ） （mg ）
（%）
测得量 回收率 平均回收 (mg)
(%) (%)
制剂批号
（mg/mL 盐酸小檗碱含量RSD （%）
声波清洗器
1.2 试剂：流动相所用甲醇为色谱纯， 1.3试药：大黄素、大黄酚对照品 三组）
2. 实验方法 2.1色谱条件与系统适应性：色谱
柱： mm 5卩m ；流动相：甲醇-0.2%磷酸（85:15）;流速：1ml/min ;进样量：10卩l ; 检测波长：254nm ;柱温：35 E 。

理论塔板数 按大黄素峰计算不低于2 000。

2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备：精密称取大黄素与大黄酚对照品适量，于50ml 量 瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配成含大黄素101.26卩g/ml 、大黄酚109.24卩g/ml 的对照品贮备溶液，再精密量取5ml 置10ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀， 配成含大黄素50.63卩g/ml 、大黄酚54.62卩g/ml 的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备：取本品20片，除去包衣，精密称定，研细（过3 号筛），精密称取适量（约相当于1片的重量），置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇 25mL 密塞，称定重量，置超声清洗器中超声 20min （超声功率为400Vy 超声频 率为40kHz ）,放冷，用甲醇补足，减失的重量，滤过。

精密量取续滤液 10 mL ，
置于烧瓶中，水浴蒸干，加30%L 醇-盐酸（10 : 1）溶液15 mL ，置于水浴中加 热水解1h ，立即冷却,用三氯甲烷强力振摇提取4d ,每次15 mL 合并三氯甲烷液， 置于水浴上蒸干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（2 ： 1）混合溶液溶解，移至25 mL 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2.1 提取方法的考察：采用本法，三黄片要研磨成细粉，加甲醇在超声波仪 上超声振荡20min 制备成供试品溶液，如超声少于20min ，则溶解不充分，影响 测定准确性，如多于20min ,于测定结果无显著差异，一般选择 20min 超声振荡 即可。

回流法是常用的提取方法，但大量有机溶剂的使用会导致环境污染， 成本
增加，有机溶剂残留等问题；相比较而言，超声法提取大黄素和大黄酚的含量与 传统回流提取法提取后的含量相当，且较回流法大大缩短了时间，可操作性强。

提取方法 （mg/g ） 超声 索氏
2.2.1.2提取时间考察 _____________________________________________________ 提取时间（h ） 面积1面积2 面积3__大黄素的含量（mg/g ）大黄酚的 含量（mg/g ）
0.5 1 1.5 2 ____________________________________________________________________ 2.2.1.3提取溶剂考察 提取溶剂 （mg/g ） 水 甲醇 乙醇
其他试剂均为分析纯。

三黄片（三组标记第一组第二组第
Dikma Diamondsil C18 (250mrK 4.6
面积1面积2面积3 大黄素的含量（mg/g ） 大黄酚的含量 面积1面积2面积3 大黄素的含量（mg/g ）大黄酚的含量
2.2.3阴性对照溶液的制备：按处方比例称取缺大黄的其它药材，按《中国药典》 一部三黄片
“制法”项下方法制成缺大黄的阴性样品，按供试品溶液制备项下方 法同法处理，即得阴性对照溶液。

在上述色谱条件下，精密吸取对照品、供试品 和阴性对照溶液各10卩I 进样测定，结果阴性样品对测定无干扰。

2.3线性关系考察：分别精密量取含大黄素（101.26卩g/ml ）、大黄酚（109.24 卩
g/ml ）的对照品溶液1ml 、2ml 、3ml 、4ml 、5ml 置5ml 量瓶中，加甲醇稀释至 刻度，摇匀，配成含大黄素 20.25卩g/ml 、40.50卩g/ml 、60.76卩g/ml 、81.01 卩 g/ml 、101.26 卩 g/ml ，含大黄酚 21.85 卩 g/ml 、43.70 卩 g/ml 、65.54 卩 g/ml 、 87.39卩g/ml 、109.24卩g/ml 的对照品溶液。

精密吸取上述对照品溶液各10卩l ， 注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并以峰面积丫为纵坐标,大黄素、大黄酚的浓 度X （卩g/ml ）为横坐标进行线性回归。

__ 进样量（ug ）__2 4 6 8__10 12 峰面积
2.4精密度试验：精密吸取2.2.1 项下对照品溶液10卩l ，按上述色谱条件连续 进样6次，记录大黄素、大黄酚的峰面积。

2.5重复性试验：称取三黄片（第一号）样品5份，按供试品溶液制备项下 方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定大黄素、大黄酚含量。

2.6稳定性试验：取同一供试品溶液（第一号），分别在制备后0、2、4、8、 12h 进样10卩l ，记录峰面积，计算结果。

2.7加样回收率试验：精密称取已知含量（第一号）的样品细粉 6份，每份 约1.5g ，置圆底烧瓶中，并精密加入浓度为0.6457mg/ml 的大黄素对照品溶液2ml 和浓度为0.9647mg/ml 的大黄酚对照品溶液3ml ，按2.2.2项下方法制备供试液， 测定峰面积。

表一大黄素加样回收率实验结果
编号 称样量（g ）样品中大黄素含量（mg 对照品加入量（mg 测得量（mg 回收率 （%平均回收率（% RSD （%
表二大黄酚加样回收率实验结果
2.8样品含量测定：取3批（第一号第二号第三号）样品，每批3份，均按222 项下同法操作，
制备供试品溶液，测定其中大黄素、大黄酚的含量。

第二组 ~第三组
组号 第一组
黄苓苷的定量检查 1仪器与试药 1. 1仪器
HP 1100型系列高效液相色谱仪（美国）；AE -240电子分析天平（瑞士 Mettler ）; KQ-250B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1. 2试药
黄苓苷对照品 仲国药品生物制品检定所,批号0826-9502）;三黄片（南宁市冠峰 制药有限公司,批号 20090601 , 20090902 , 20090906 ,规格为每片片芯重
0.25g ）;甲醇为色谱纯（德国M erck ）,水为超纯水（韩国Po w er Iplus 超纯水系 统）,其他试剂均为分析纯。

2方法与结果 2. 1色谱条件
色谱柱：Hypersi l ODS2 （ 4.6mm # 200mm,5um ）;流动相：甲醇 -0.2 % 磷酸溶 液（45:55 ）;检测波长：280nm;流速：1.0 mL/min ;柱温：30C 。

进样量：10uL 。

理论板数按黄苓苷峰计算应不低2500。

在此条件下,黄苓苷与相邻峰可达基线分 离，方中其他成分对测定无干扰， 2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备
精密称取在60r 减压干燥4h 的黄苓苷对照品约20mg ,置于50mL 量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度。

再精密吸取 0.5 , 1.0, 2.0,4.0,6.0mL 置20mL 量瓶 中，配成各个浓度的黄苓苷对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备
取本品20片，除去包衣，精密称定，研细（过三号筛），精密称取约0.05g ,置 具塞三角瓶中,精密加入70 %乙醇50mL ,密塞,称定重量,超声提取30min , 放冷,补足重量,过滤,取滤液适量即得。

提取方法 超声 索氏
2.2.1.2提取时间考察 提取时间（h ）
0.5 1 1.5 2 _________
2.2.1.3提取溶剂考察 提取溶剂 水 甲醇 乙醇
2.2.3阴性样品的制备
按处方比例制备缺黄苓的三黄片，照2.2.2项下操作，制备阴性样品溶液。

2.3线性关系考察
面积1 面积2 面积3 黄苓苷的含量（mg/g ） 面积1面积2 面积3 黄苓苷的含量（mg/g ）
面积1面积2面积3 黄苓苷的含量（mg/g ）
分别精密量取各个黄苓苷对照品溶液 10uL ,依次进样，测定峰面积。

以测得的 峰面积为纵坐标，对照品进样量(ug)为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程丫=
3 866.2 X -87.923 , r = 0.999 8 ,黄苓苷进样量在 0.1~ 1.2ug 内呈良好的线性关 系。

2.3.1提取溶剂考察 __________________________________________ 进样量(ug )__2
4 6 8 10 峰面积 甲醇 乙醇
2.4精密度试验
精密吸取同一批供试品溶液，重复进样6次，依法测定，黄苓苷峰面积的 0.6%,结果表明仪器精密度良好。

2.5稳定性试验
取同一对照品溶液10uL,按上述色谱条件分别在 0, 4,8 , 12 , 16,20h 次，，记录峰面积积分值并计算出黄苓苷的 RSD = 1.1 % ,结果显示溶液 稳定。

2.6重复性试验
取同一批号的供试品6份，依法制成供试品溶液进行测定，RSD = 1.9 % ,结果 表明重复性良好。

2.7回收率试验
取已知含量(14.26mg /0.293 4g)的同一批号供试品6份，分别精密加入浓度为 2 mg/mL 的对照品溶液05mL,照2.2.2项下操作，制备样品溶液。

按色谱条件 测定含量，计算回收率，结果见表1。

序号 取样量 样品中含量 测得量 回收率 平均回 收率 RSD
(g) (mg) (mg) (%) (%)
(%)
1 2 3 ________________________________________________________ 注：黄苓苷对照品加入量均为__1.000 0m g 2.8样品含量测定
分别精密量取3批三黄片1g ,按2.2.2项方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱 仪，计算样品中黄苓苷的含量，结果见表 2。

参考文献：
1. H PLC 法测定复方苦参子洗液中盐酸小檗碱的含量 -------- 陶景芬
2. 薄层色谱法鉴别加味三黄片的有效成 _省略_描法测定加味三黄片中小檗碱的
含量 -------------------------------------- 杨建明
RSD= 测定6 20h 内
3. 四季三黄片和四季三黄丸薄层色谱分析 --------------
4. 四季三黄片质量控制方法的研究 ----------------
5.. ------------------------------------------------------------------------ H PLC 法测定三黄片中大黄素及大黄酚的含量 ---------------
6.. ------------------------------------------------------------------------ HPLC 测定三黄片中大黄素_大黄酚
及黄苓苷的含量 ----------------------------------------
7.. 超声提取合HPLC 测定三黄片中大黄素和大黄酚的含量---
8. 高效液相色谱法测定苓玄颗粒中黄苓苷含量 ------------ 9. HPLC 法测定产后补丸中黄苓苷含量 ---------------------
10. HPLC 法测定伤科跌打片中大黄素大黄酚的含量
姜春霞
沁园春・f
顿失滔滔。

比高。

江山如此多娇，引无数英雄竞折腰 惜秦皇汉武，略输文采；唐宗宋 祖，稍逊风骚。

北国风光，千里冰封, 里雪飘。

望长城内外,
惟余莽莽;
大河
宋文焕 卞艳晶
---- 刘素兰
---- 李淑盈 ------- 王洁 ----- 李翔 ----- 袁萍
山舞银蛇，原驰蜡象,
欲与天公试
须晴日，看红装素裹,
分外妖娆。

一代天骄，成吉思汗，只识弯弓射大雕。

俱往矣，数风流人物，还看今朝。

V r克。