番荔枝内酯对人淋巴瘤Raji细胞体外增殖和凋亡的影响

番荔枝内酯对人淋巴瘤Raji细胞体外增
殖和凋亡的影响
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
【摘要】目的研究番荔枝内酯对体外人淋巴瘤Raji细胞体外增殖和凋亡的影响及其可能机制。

方法将体外培养的Raji细胞分为番荔枝内酯组、阿霉素对照组及未干预组,番荔枝内酯药物浓度按6.25、12.5、25、50 μg/mL分级作用于细胞。

采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化染色检测各组细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)的表达情况。

结果番荔枝内酯组细胞增殖率均低于未干预组,25、50 μg/mL药物浓度组细胞增殖率低于阿霉素组,增殖率与浓度及培育时间负相关；番荔枝内酯组细胞凋亡率高于未干预组,25、50 μg/mL药物浓度组凋亡率高于阿霉素组,和浓度、时间正相关；与未干预组相比,番荔枝内酯组caspase-9表达量逐步增加,与阿霉素组比较,6.25 μg/mL组caspase-9表达低于阿霉素组(P＜0.05),50 μg/mL浓度组表达高于阿霉素组(P＜0.05)。

结论番荔枝内酯对体外人淋巴瘤Raji细胞的增殖有抑制作用,并可能通过线粒体途径促进其凋亡。

【关键词】番荔枝内酯；抗肿瘤；凋亡；增殖；caspase-9；Raji 细胞
Abstract：Objective To investigate the effects of annonaceous acetogenin on proliferation and apoptosis in Raji cells and its mechanism. Methods Raji cells cultured in vitro were divided into control group, annonaceous acetogenin group and adriamycin group. Raji cells were effected by 6.25, 12.5, 25, 50 μg/mL annonaceous acetogenin. Proliferation of Raji cells were evaluated by MTT assays, apoptosis percentage was assessed by flow cytometry. Caspase-9 protein was detected by immunohistochemistry. Results The Raji cell proliferation rate of annonaceous acetogenin decreased compared with the control, that of 25, 50 μg/mL group were lower than adriamycin group, and it was related to the concentration, relying on the incubating time. The apoptosis rate was higher than control, that of 25, 50 μg/mL group were higher than adriamycin group, and it was related to the concentration and the incubating time. The expression of caspase-9 protein of annonaceous acetogenin group was higher than control, and it had a positively relationship with the concentration and incubating time. Conclusions Annonaceous acetogenin could inhibit cell proliferation in a dose-dependent and time-dependent manner in Raji cells, and it may induce Raji cells
apoptosis by up-regulating caspase-9 expression.
Key words：annonaceous acetogenin；antitumor；apoptosis；proliferation；caspase-9；Raji cell
番荔枝(Annona squamosa Linn.)为番荔枝科番荔枝属植物,我国广东、广西、海南、福建、云南等省及台湾地区均有栽培,东南亚、南美国家及地区也有广泛分布。

番荔枝内酯(annonaceous acetogenins)分布在番荔枝科多种植物的根、树皮、种子、叶以及果实中。

研究表明番荔枝内酯是一类很有希望的新抗癌药物。

笔者研究番荔枝内酯在淋巴瘤治疗中的应用,现将体外实验结果报道如下。

1 实验材料
1.1 药物
番荔枝内酯类化合物：为本研究组参照Dos Santos等[1]方法从番荔枝种子中提取分离所得,为白色蜡状粉末。

使用前以少许无水乙醇溶解,加生理盐水配制成所需浓度,乙醇终浓度不超过1%；盐酸阿霉素为意大利法玛西亚公司产品。

1.2 主要试剂
四甲基偶氮唑蓝(MTT,美国Sigma公司),AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 (caspase-9)免疫组化试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)。

1.3 瘤株
人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞购自华中科技大学同济医学院
免疫教研室,并由本院实验室传代保存。

2 实验方法
2.1 分组
番荔枝内酯组：细胞培养基中加入生理盐水溶解的番荔枝内酯,实验终浓度分别为6.25、12.5、25、50 μg/mL；未干预组：细胞培养基中加入与实验组等体积的生理盐水；阿霉素组：细胞培养基中加入生理盐水溶解的阿霉素,终浓度为0.1 μg/mL。

2.2 MTT比色试验
取处于对数生长期的Raji细胞1×105/mL,接种于96孔培养板,分别加入不同浓度番荔枝内酯以及阿霉素各10 μL,孵育24、48、72 h。

孵育结束前4 h,各培养孔加入MTT(5 mg/mL)10 μL,离心,弃上清,加入10%二甲基亚砜震荡溶解结晶,上酶标仪于波长λ＝492 nm处测吸光度(OD)值。

通过OD值计算细胞增殖抑制率。

流式细胞仪测定细胞凋亡率。

细胞增殖抑制率(%)＝(未干预组OD均值－实验组OD均值)/未干预组OD均值×100%。

2.3 实验步骤
严格按照AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒说明进行。

每份样品检测105个细胞,双参数结果以二维散点图显示,数据由FCM的计算机软件分析输出。

2.4 免疫细胞化学法检测caspase-9蛋白表达
将处理组和对照组细胞用PBS洗1遍,调整细胞浓度1×105/mL,取50 μL滴片,无水丙酮固定20 min,晾干。

严格按照试剂盒操作步骤
进行,滴加正常山羊血清,一抗caspase-9兔抗人多克隆抗体,二抗山羊抗兔IgG孵育,滴加辣根酶标记工作液,DAB显色,苏木素轻度复染,中性树脂封片。

以PBS代替一抗作染色的阴性对照。

结果判定：细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞,在高倍光镜下至少观察200个细胞,计算阳性细胞数。

3 统计学方法
数据为计量资料。

统计分析采用SPSS13.0软件。

实验数据以x±s表示,多组间比较用方差分析,2组间比较用t检验；以P＜0.05认为差异有统计学意义。

4 结果
4.1 番荔枝内酯对细胞caspase-9蛋白表达的影响
在番荔枝内酯组中,随着药物浓度的增大、作用时间的延长,细胞中caspase-9蛋白表达量逐步增加,与未干预组比较,各组表达量均高于未干预组(F＝43.25,P＜0.05)。

与阿霉素组比较,番荔枝内酯12.5、25 μg/mL组无统计学意义,6.25 μg/mL组caspase-9表达低于阿霉素组(P＜0.05),50 μg/mL浓度组表达高于阿霉素组(F＝27.68,P＜0.05)。

见表1。

表1 各组不同时点Raji细胞caspase-9蛋白表达的比较(略)注：与未干预组比较,★P＜0.05；与阿霉素组比较,△P＜0.05(下同)
4.2 番荔枝内酯对细胞增殖的影响
细胞增殖率与阿霉素、番荔枝内酯药物作用时间呈依赖性,并与番荔枝内酯药物浓度呈负相关,r＝-0.67,P＜0.05。

番荔枝内酯组对细胞
增殖率影响除6.25 μg/mL浓度组在24 h作用点时与未干预组差异无统计学意义外,余浓度组及作用时间点与干预组比较,差异均有统计学意义(F＝53.64,P＜0.05)。

番荔枝内酯6.25 μg/mL组在各个作用时间点对细胞增殖率均高于阿霉素组,但随着浓度的增加,增殖率逐步降低,至25 μg/mL浓度组时,增殖率低于阿霉素组(F＝25.37,P＜0.05)。

见表2。

表2 各组不同时点Raji细胞增殖率比较(略)
4.3 番荔枝内酯对细胞凋亡的影响
Raji细胞凋亡率与番荔枝内酯药物浓度呈正相关(r＝0.72,P＜0.05),并有时间依赖性。

番荔枝内酯组除6.25 μg/mL组于24 h作用点时与未干预组差异没有统计学意义外,其余浓度组及作用时间点与未干预组比较,均高于未干预组,差异有统计学意义(F＝33.632,P＜0.05)。

番荔枝内酯25、50 μg/mL组细胞凋亡率高于阿霉素组,6.25 μg/mL 组细胞凋亡率低于阿霉素组(F＝27.623,P＜0.05),12.5 μg/mL组与阿霉素组差异没有统计学意义。

见表3。

表3 各组不同时点Raji细胞凋亡率比较(略)
5 讨论
番荔枝内酯又称为番荔素、番荔枝皂素、番荔枝乙酞苷元和番荔技乙酞精宁等,共有6种结构类型：单四氢呋喃环型,邻双四氢呋喃环型,间双四氢呋喃环型,裂双四氢呋喃环型,邻三四氢呋喃环型,裂三四氢呋喃环型。

目前其主要来源是通过从番荔枝科植物中采用天然加工方法提取,成本低,产率高,其有广泛生物活性的天然成分,能发挥驱虫、抗微生物、抗寄生虫、抗疟、抗肿瘤等作用,故而日益受到学者们的广
泛关注,现今报道,从番荔枝科植物中提取的番荔枝内酯化合物达300余种[2]。

自1982年Jolad等首先从番荔枝科的紫玉盘属植物中分离出一种具有抗肿瘤活性的内酯以来,引发了对番荔枝内酯抗肿瘤作用的研究热潮[3-4]。

番荔枝内酯中抗癌活性最强的内酯是泡番荔枝辛(bullatacin),按重量计算为紫杉醇抗白血病作用的300倍,被誉为明日抗癌之星[5]。

其他如asimicin、trilobacin、trilobin、squamocin等也都具有较强的抗癌活性[6]。

Huang等[7]将番荔枝内酯用于诱导体外胃癌细胞的凋亡研究获得成功；Lu等[8]发现番荔枝内酯squamocin对人体外白血病细胞有抑制作用,可呈浓度依赖性地将细胞增殖阻滞于G2/M期；任氏等[9]观察了番荔枝内酯对肝癌细胞的影响,发现番荔枝内酯对体外肝癌细胞增殖有抑制作用,并随药物浓度的增加而抑制作用增强。

目前关于番荔枝内酯对人淋巴瘤Raji细胞作用研究还少有报道。

番荔枝内酯引起细胞凋亡的机制目前尚没有完全一致的结论。

番荔枝内酯是一条以含末端Y-内酯环及四氢呋喃环为主要结构特征的长烷基链化合物,对线粒体复合物Ⅰ具有强烈抑制作用,其作用机理可能是通过抑制线粒体NADH氧化还原酶,从而阻止呼吸链电子的传递,使ATP产生迅速减少。

由于能量的减少引起可渗透性糖蛋白(P-gp)功能的减弱及随后的细胞凋亡,并用此作为番荔枝内酯应用于多重耐药癌细胞治疗的理论依据[10]。

也有报道说番荔枝内酯可通过使肿瘤细胞内cAMP和cGMP水平的降低,从而诱导了凋亡[11]。

另
外,番荔枝内酯可能引起细胞内活性氧的增加和线粒体膜电位的降低,活性氧的大量释放和线粒体膜电位的降低均能引起caspase-9的释放,从而激活了caspase-3,活化的caspase-3使其底物PARK 降解,从而诱导肿瘤细胞的凋亡[12]。

本研究通过MTT比色法和流式细胞仪分别检测了番荔枝内酯对体外培养人淋巴瘤Raji细胞增殖和凋亡的影响,实验结果表明,番荔枝内酯显著抑制Raji细胞增殖,促进其凋亡,并在一定范围内与作用时间、药物浓度成正相关。

阿霉素是目前淋巴瘤药物治疗的一个经典用药,本实验用其作为阳性对照,结果表明,阿霉素对抑制Raji细胞的增殖和促进其凋亡都有明显作用,与其比较发现,番荔枝内酯在较低剂量(12.5 μg/mL)时即能达到常规剂量阿霉素的作用效果,浓度提高甚至超过阿霉素的作用效果。

已知细胞凋亡有两条途径[13-14]：一是死亡受体途径,为肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员参与的通过caspase-8活化的途经,又称为外源性凋亡途径；二是线粒体途径,为细胞色素-C参与的通过caspase-9活化的途径,又称为内源性凋亡途径。

两条途径最后均通过激活下游的效应因子caspase-3,7使细胞发生凋亡。

caspase-9是内源性凋亡途径的启动因子,caspase-3则被认为是涉及两条途径的重要效应caspase。

细胞凋亡不仅在肿瘤的发生发展过程中起重要的作用,而且与肿瘤治疗和药物敏感机制以及耐药性有关,目前已发现大多数抗癌药发挥其抗癌效应是通过诱导肿瘤细胞凋亡[15-16]。

本实验通过细胞免疫组化检测细胞的caspase-9蛋
白表达,发现随番荔枝内酯实验浓度加大和作用时间的延长,caspase-9蛋白表达增多。

结果提示,番荔枝内酯诱导Raji细胞的凋亡伴caspase-9的高表达,该药可能通过线粒体途径诱导Raji细胞凋亡。

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