病毒滴度测定
病毒TCID50测定
病毒TCID50测定病毒TCID50测定是一种常见的病毒滴度测定方法。
下面将介绍具体的操作步骤。
首先，需要准备好细胞。
取出一块细胞培养板，每个孔铺成单层大约60％丰度即可接种病毒。
对照选取16个孔即可。
注意不要窜孔，保证实验条件一致。
其次，稀释待测病毒液。
可以采用A法或B法。
在A法中，向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液，依次10倍系列稀释至适宜浓度。
在B法中，可以根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数，并根据接种的孔数稀释病毒。
接下来，进行接种。
用多道加样器吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液。
将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。
切记要设置正常的细胞对照，每次实验要重复4次，计算标准差。
最后，进行培养。
37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液，加入维持液200µl继续在37℃CO2培养箱中培养。
实验方法将待检病毒接种于细胞培养物中，培养时间为5天，培养温度为37℃，CO2浓度为5%。
测定结果取出培养板，使用显微镜观察细胞病变情况。
根据病变程度，计算出病毒的浓度。
计算方法1) ___-Karber法利用病变程度计算出病毒的50%细胞传染量（CCID50），计算公式为：LgCCID50/0.2ml= -（X-d/2 + d×∑R1/N1）,其中X代表全部病变最低稀释度对数，d代表稀释因数对数，N1代表每个稀释度所种的孔数，R1代表病变孔数，∑代表积和。
2) Reed-Muench法观察细胞病变情况，找出能引起半数细胞感染的病毒稀释倍数，按照Reed和Muench公式计算出该病毒液的50%细胞传染量（TCID50）。
根据实验结果，能使50%细胞感染的病毒稀释度在10^-4~10^-5之间，根据Reed和Muench公式计算出TCID50.。
tcid50计算方法
tcid50计算方法TCID50计算方法。
TCID50是一种用于测定病毒感染力的方法，它是一种常用的病毒滴度测定方法，也是一种间接滴度测定方法，其全称为50%组织培养传染病毒感染量。
TCID50的计算方法对于病毒学研究和病毒治疗具有重要意义。
下面将介绍TCID50的计算方法。
首先，准备一系列含有不同稀释度的病毒悬液，通常是10倍稀释。
然后将这些病毒悬液分别接种到一系列细胞培养物中，每种稀释度接种若干个孔。
接种后，将培养皿放入恒温箱中培养一段时间，等到细胞出现病毒感染的特征，如细胞变形、溶解等。
接下来，观察每个孔中细胞的感染情况，记录下每个稀释度下有感染的孔数。
然后，根据每个稀释度下的感染孔数，利用统计学方法计算出病毒的滴度。
TCID50的计算方法是根据每个稀释度下的感染孔数，利用统计学方法计算出病毒的50%感染量。
具体计算方法是通过对每个稀释度下的感染孔数进行Log10转换，然后利用线性插值法计算出50%感染量对应的稀释度。
最后，根据插值计算出的稀释度，可以得出病毒的TCID50值。
在进行TCID50计算时，需要注意以下几点。
首先，稀释度的选择要合适，一般需要选取一系列不同浓度的病毒悬液，以便可以观察到感染孔数的变化。
其次，接种细胞的方法和条件要统一，以保证实验结果的可比性。
最后，对于每个稀释度下的感染孔数，需要进行统计学分析，确保计算出的TCID50值准确可靠。
总之，TCID50的计算方法是一种重要的病毒滴度测定方法，通过对不同稀释度下的感染孔数进行统计学分析，可以计算出病毒的50%感染量，从而评估病毒的感染力。
这种方法在病毒学研究和病毒治疗中具有重要意义，可以为疾病的预防和控制提供重要依据。
因此，研究人员在进行病毒感染力的测定时，可以选择TCID50的计算方法，以获得准确可靠的实验结果。
病毒滴度测定知识讲解
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。
第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ；换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。
稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。
放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。
第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
病毒滴度测定
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3．PFU（空斑形成单位）4．TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
吉凯基因慢病毒滴度检测方法
吉凯基因慢病毒滴度检测方法逐孔稀释滴度测定法:一：样品准备1.检测前一天，对293T 细胞传代，每个24 孔中加１×105 个细胞，体积为500μL；2.次日，准备7~10 个无菌的Ep 管，在每个管中加入90 μL 的培养基（DMEM+10%FBS）；3.取待测定的病毒原液10μL 加入到第一个管中，混匀后，取10 μL 加入到第二个管中。
继续相同的操作直到最后一管；4.选取所需的细胞孔，吸去90 μL 培养基。
加入稀释好的病毒溶液。
放入37℃5%CO培养箱中培养；25.48 小时后，加入新鲜培养基500 μL。
小心操作，不要吹起细胞；6. 4 天后，抽提RNA 准备做RT-qPCR。
二：Real time 定量PCR 法测定滴度具体操作内容参考“吉凯基因慢病毒包装手册”14页“2) Real time 定量PCR 法测定滴度”三：滴度计算方法1.加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总RNA后反转录为cDNA，然后进行定量PCR检测，通过比较control组和试验组的Ct值差异判断滴度值。
通常情况下，认为Ct值差异2以上存在显著差异。
2.反转录反应所获得的20 μL cDNA中只取了1 μL用于实时定量检测，所以该结果仅表示1/20样品的情况，所以在滴度计算时应该乘以系数20。
3.例如：若某次滴度检测中，1.00E-05 μL组样品和control组样品的Ct值存在2个左右差异，则认为在1.00E-05 μL组样品中存在病毒颗粒。
假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：1/(1.00E-05) *20＝2.00E+6 TU/μL=2.00E+9 TU/ml。
四：融解曲线说明由于SYBR GreenⅠ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。
通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。
由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR Green Real-Time PCR定量结果。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定是一种用于确定病毒在溶液中的浓度的方法。
它通常用于病毒学研究、疫苗生产和药物研发等领域。
正确的病毒滴度测定方法可以帮助科研人员准确地评估病毒的活性和浓度，从而为相关研究工作提供可靠的数据支持。
下面将介绍几种常用的病毒滴度测定方法。
一、细胞培养法。
细胞培养法是一种常用的病毒滴度测定方法。
首先，将待测病毒样品与细胞培养基混合，然后在培养皿中接种一定数量的细胞，并将混合液加入培养皿中。
接下来，将培养皿放入恒温培养箱中，培养一定时间后观察细胞的感染情况，根据感染细胞的数量可以计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
血凝法是另一种常用的病毒滴度测定方法。
这种方法利用病毒对红细胞的凝集作用来确定病毒的滴度。
首先，将一定浓度的病毒样品与红细胞混合，然后在琼脂培养皿中进行凝集反应。
根据凝集的程度和范围可以计算出病毒的滴度。
三、动物接种法。
动物接种法是一种直接将病毒样品接种到动物体内，通过观察动物的感染情况来确定病毒滴度的方法。
这种方法通常用于病毒毒力的测定。
通过确定50%动物传染单位（TCID50）或50%致死剂量（LD50）来表示病毒的滴度。
总结。
以上介绍了几种常用的病毒滴度测定方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行病毒滴度测定时，需要根据实际情况选择合适的方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文对您有所帮助。
病毒滴度的测定
病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。
放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。
第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。
定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。
每孔细胞为5×104个。
接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。
在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl 的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI 的新鲜培养基。
在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。
然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。
用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。
用培养基吹洗下，离心收集细胞。
怎么检测慢病毒滴度呢？
怎么检测慢病毒滴度呢？
滴度（Titer）：单位体积中有感染能力的病毒数目；单位：TU/mL（活性滴度单位）。
通常来说LV滴度检测：越准确，就越花时间；越省事的，就越不准确。
根据并不是所有的实验要求都需要精确检测，例如对于构建基因稳定过表达或干扰表达（shRNA）的细胞株，由于有后续的筛选的过程，就可采取快速检测法（死病毒也会检测出来）。
LV滴度的快速检测包括QPCR，ELISA和试纸法。
其差异在于，QPCR法：检测病毒核酸量；ELISA法：检测病毒衣壳蛋白量；试纸法：检测病毒p24衣壳蛋白含量。
而对于做RNAi-screening或CRISPR-screening等研究，则需要精确检测LV的滴度，包括荧光报告基因法和抗生素筛选法。
病毒滴度
二、空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。
这一方法得到的结果往往最不稳定。
1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。
或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。
2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。
第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。
稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。
稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。
用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。
换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。
然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。
注意：每次稀释时都必须换用新枪头。
3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。
4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。
5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。
21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。
结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。
三、50%组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法（一）细胞准备：1．收集一瓶细胞，计数。
2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。
3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。
（二）准备稀释病毒液1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。
慢病毒滴度检测——ELISA法VS qPCR法
慢病毒滴度检测——ELISA法VS qPCR法
慢病毒滴度检测是检验慢病毒是否合格的方法之一。
在一些特定的实验中，我们需要为病毒的浓度，即滴度，进行测定。
由于慢病毒载体的不同以及客户需求的不同，有的慢病毒会带有荧光标记，而有的没有，故而滴度检测也有不同的方法。
一、ELISA法
传统的p24 ELISA可检测到293细胞在瞬时转染过程中产生的病毒相关p24和游离p24，而游离的p24可以占上清液中p24总量的很大一部分。
因此，传统的p24 ELISA通常会高估存在的慢病毒的数量。
新的QuickTiter慢病毒滴度试剂盒（与慢病毒相关的HIV p24）可最大程度地减少此问题。
一项专有技术可在运行测定的ELISA部分之前，将慢病毒与溶液中的游离p24分离。
二、Real-time PCR法
GeneCopoeia的Lenti-Pac 慢病毒滴度检测试剂盒系列产品为简便、快速检测慢病毒颗粒的滴度而设计。
试剂盒包含从RNA抽提到qRT- PCR检测过程的全套试剂，样品经过RNA抽提、DNase消化、反转录、qRT-PCR步骤即可确定慢病毒滴度。
特点：
1.能够判断慢病毒是否包装成功；
2.准确测定病毒拷贝数，以确保细胞转导和基因表达的效率；
3.提供滴度检测过程从病毒的RNA提取到qPCR检测所需要的试剂。
综上，慢病毒滴度检测：ELISA法结合qPCR法，想怎么测就怎么测~
文章来源：武汉艾美捷科技。
tcid50计算方法
tcid50计算方法TCID50计算方法。
TCID50是一种常用的病毒滴度测定方法，它是通过观察病毒对细胞的感染情况来确定病毒的滴度。
TCID50的全称是50%组织培养传染病毒量，它表示在一定条件下，使50%的感染细胞发生病毒感染所需要的最小病毒量。
下面将详细介绍TCID50的计算方法。
首先，准备好所需的试剂和设备。
在进行TCID50测定之前，需要准备好含有细胞的培养皿、含有不同稀释度病毒的培养皿、含有培养基的培养皿以及其他必要的试剂和设备。
其次，进行病毒的稀释。
将含有高浓度病毒的培养液进行稀释，通常是10倍或100倍的稀释。
将每种稀释度的病毒分别加入到含有细胞的培养皿中，然后放置一段时间让病毒感染细胞。
接着，观察细胞的感染情况。
经过一定时间的培养后，观察细胞的情况，看是否有细胞出现病变、溶解或其他异常情况。
根据不同稀释度的病毒培养皿的感染情况，可以初步确定病毒的滴度范围。
然后，进行TCID50的计算。
根据不同稀释度的病毒培养皿的感染情况，可以利用统计学方法计算出50%感染细胞所需的最小病毒量。
这个计算过程通常是通过对数概率方法进行计算，得出TCID50的值。
最后，进行结果的分析和报告。
根据实验结果，可以对病毒的滴度进行分析，得出病毒的感染能力和传播能力。
将实验结果进行报告，对病毒的滴度进行描述和说明。
总之，TCID50是一种常用的病毒滴度测定方法，通过对病毒感染细胞的情况进行观察和计算，可以得出病毒的滴度值。
掌握好TCID50的计算方法对于病毒学研究和病毒感染机制的研究具有重要意义，希望本文对您有所帮助。
病毒滴度
二、空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。
这一方法得到的结果往往最不稳定。
1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。
或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。
2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。
第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。
稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。
稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。
用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。
换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。
然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。
注意：每次稀释时都必须换用新枪头。
3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。
4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。
5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。
21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。
结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。
三、50%组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法（一）细胞准备：1．收集一瓶细胞，计数。
2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。
3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。
（二）准备稀释病毒液1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。
病毒滴度的测定
空斑形成单位法测定病毒滴度
空斑显现原理(掌握)：空斑形成后，经中性红 活细胞染色，活细胞显示红色，而空斑区细胞 不着色，形成不染色区域。
Procedures
空斑形成单位法测定病毒滴度
适用条件 (熟悉)：凡是能在细胞中产生细胞病 变效应 (CPE) 的病毒都可以采用空斑形成法测 定病毒滴度。
(掌握)
Karber法计算CCID50
病毒液稀释度
10-1
(难点、重点)
出现CPE孔的比率
8/8=1
10-2
10-3
8/8=1
7/8=0.875
10-4
10-5
3/8=0.375
1/8=0.125
10-6
0/8=0
lgCCID50=L+d(s-0.5) L: 病毒的最低稀释倍数的对数 L=lg10-1 = -1
病毒滴度的测定ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
空斑形成单位法测定病毒滴度
原理(重点)：适当稀释的病毒悬液与长成单 层的宿主细胞混合，在细胞上覆以营养琼脂培 养基等固体或半固体介质，由于琼脂的限制，
病毒只能感染并破坏临近的细胞，造成细胞溶
解而形成空斑，每个空斑由一个病毒颗粒造成，
计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的
病毒感染单位的浓度。 空斑形成单位（Plaque Forming Units, PFUs)
中性红
(熟悉)
(了解)
(了解)
空斑形成单位试验技术举例 p51-52 防止琼脂凝固； Hanks液？ 双抗？ 5% CO2
空斑形成单位的计算 (重点)
(掌握)
(熟悉)
(重点)
LD50
ID50
CCID50
(熟悉)
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法病毒滴度测定方法是一种用于测定病毒在溶液中的浓度的实验方法。
病毒滴度是指单位体积中含有的病毒颗粒数，通常以每毫升（mL）为单位。
病毒滴度的测定对于病毒学研究和疫苗生产具有重要意义。
本文将介绍常见的病毒滴度测定方法及其操作步骤。
一、细胞培养法。
1. 准备培养皿和细胞悬液，将含有适量细胞的培养皿放入培养箱中孵育，直至细胞生长至适当密度。
用无菌PBS或生理盐水洗涤细胞，用含有适量生长培养基的管中悬浮细胞。
2. 制备病毒稀释液，将病毒溶液以一定比例加入生长培养基中，得到一系列不同浓度的病毒稀释液。
3. 感染细胞，将不同稀释度的病毒溶液加入培养皿中的细胞悬液，孵育一定时间后观察细胞形态变化。
4. 计算滴度，根据感染的细胞数量和病毒稀释液的稀释倍数，利用统计学方法计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
1. 准备血凝管，将一定量的新鲜血液加入血凝管中，加入适量的病毒溶液，轻轻摇匀。
2. 孵育，将血凝管放置在37摄氏度的恒温箱中孵育一段时间，观察血凝情况。
3. 计算滴度，根据血凝管中凝结的情况，结合之前加入的病毒溶液的稀释倍数，计算出病毒的滴度。
三、组织培养法。
1. 准备组织培养皿和组织细胞，将含有适量细胞的组织培养皿放入培养箱中孵育，直至细胞生长至适当密度。
2. 感染组织细胞，将病毒溶液加入培养皿中的组织细胞，孵育一定时间后观察细胞形态变化。
3. 计算滴度，根据感染的细胞数量和病毒溶液的稀释倍数，利用统计学方法计算出病毒的滴度。
以上是常见的病毒滴度测定方法及其操作步骤，选择合适的方法取决于实验目的、病毒类型和实验条件。
在进行病毒滴度测定实验时，应严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文能对病毒滴度测定方法有所了解和帮助。
tcid50法
tcid50法TCID50法是一种常用的病毒滴度测定方法，用于评估病毒溶液中的活性病毒数量。
TCID50是指病毒的50%组织细胞传染性滴度。
病毒滴度是指病毒溶液中含有多少活性病毒颗粒的浓度。
确定病毒滴度的目的是为了量化病毒溶液中的活性病毒数量，从而为研究人员提供准确的病毒浓度信息，用于病毒研究、疫苗制备和药物筛选等领域。
TCID50法是通过对细胞培养物进行稀释接种，然后观察细胞的病毒感染情况来测定病毒滴度的一种方法。
具体操作过程如下：将细胞培养物均匀地分配到培养皿中。
然后，将病毒溶液进行一系列的稀释，每次稀释一倍，得到一系列的稀释液。
接下来，将每个稀释液滴加到培养皿中的不同孔上。
然后，将培养皿放入恒温培养箱中，让病毒与细胞进行接种。
接种一段时间后，观察培养皿中细胞的感染情况。
可以通过显微镜观察细胞形态的变化，或者通过染色等方法来观察病毒感染的细胞。
根据感染细胞的数量和稀释液的稀释倍数，计算出病毒的TCID50值。
通常，TCID50值是通过统计病毒感染和未感染细胞的比例来计算的。
TCID50值越高，表示病毒的传染性越低；而TCID50值越低，表示病毒的传染性越高。
因此，通过TCID50值可以评估病毒的感染能力和传播能力。
TCID50法具有操作简单、结果可靠的优点，因此被广泛应用于病毒研究和疫苗制备过程中。
通过测定病毒的TCID50值，可以帮助研究人员评估病毒的传播能力和感染能力，从而指导病毒研究和疫苗制备的实验设计。
TCID50法是一种常用的病毒滴度测定方法，通过对细胞培养物进行稀释接种，然后观察细胞的病毒感染情况来测定病毒滴度。
通过测定病毒的TCID50值，可以评估病毒的传播能力和感染能力，为病毒研究和疫苗制备提供准确的病毒浓度信息。
病毒滴度的测定
病毒滴度的测定病毒感染的测量方法–直接计数法将病毒与乳胶颗粒混合电子显微镜观测缺点是无法判断病毒的感染性–间接计数法空斑形成单位plaque forming unitsPFUs 50终点法血凝试验干扰滴定第一节空斑形成单位法一、基本原理原理–空斑形成单位plaque forming unitsPFUs试验将不同稀释倍数的病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合当病毒感染时会造成宿主细胞溶解而形成空斑每个空斑系由一个病毒颗粒引起计数空斑数目再乘稀释倍数得病毒感染的浓度–病毒空斑—蚀斑将病毒稀释后移入单细胞培养瓶中吸附1h后覆盖营养琼脂病毒在琼脂中只感染临近的细胞形成空斑的退化细胞区中性红染色活细胞染红色死细胞无色产生CPU的病毒均可用此方法二、方法与步骤测定病毒空斑的试验方法–病毒杀死感染细胞的检测产生细胞病变效应中型红活细胞染红色台盼兰死细胞染蓝色MTT溴化二苯基四氮唑将活细胞染成深蓝色易于计数易分离病毒转化或有抵抗力的细胞–未能杀死细胞可产生血凝素因能吸附红细胞空斑用血吸附显出用显微镜计数吸附红细胞的空斑–细胞融合病毒感染细胞与临近的未感染细胞融合形成多核细胞用显微镜观查合胞体空斑–空斑中含有病毒的抗原免疫荧光分析–免疫组化技术生物素-抗生物素-过氧化物酶染色技术间接免疫过氧化物酶染色三、空斑形成单位法测定病毒滴度的计算空斑形成单位试验技术–传代细胞平皿法单层细胞浓度为2×106培养液为RPMI1640EagleMEM 病毒液稀释在冰浴盘作10倍稀释每个稀释度培养2瓶每加一次样时要新吸管来回吸三次加至培养瓶无细胞层的瓶壁底角再倾斜来回摇动使病?揪 ? CO2孵箱吸附90min后再用营养琼脂覆盖培养58d后加入0.01的中性红染色计数空斑病毒滴度的计数–按以下公式计算空斑形成单位PFUs/ml dvnn21X1、X2、Xn表示同一稀释度在不同培养孔板实验单位中数得到的空斑数n表示计数空斑的培养板孔数v表示病毒量mld表示稀释倍数例以稀释成10-4的病毒悬液感染细胞四个培养板孔中的空斑数分别为113及5个接种量为0.2 ml 空斑形成单位PFUs/ml 4100.245311 1.25×105PFUs/ml 空斑形成单位PFUs与重复感染数M.O.I –重复感染数Mutiplicity of InfectionM.O.I是指感染一个细胞的病毒颗粒的平均数–一般来说M.O.I值越大则实验细胞被感染的比例越大–若某病毒的PFUs 已经测得要按一定量的M.0.I进行感染细胞时则所需的病毒量可按公式1和2计算公式1实验细胞数×所需的M.O.I值所需的PFUs 公式2所需的PFUs/实际病毒的PFUs需要加的病毒量例已知某病毒的滴度为1.3×1011 PFUs/ml试验细胞数为每孔1.8 ×106计划M.O.I值为200。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法病毒滴度测定是一种用于测定病毒浓度的方法，通常用于病毒学研究和疫苗生产中。
病毒滴度测定的结果可以帮助科研人员和生产工作者准确地了解病毒的数量，为后续的实验和生产提供重要参考。
本文将介绍病毒滴度测定的常用方法及操作步骤。
首先，进行病毒滴度测定需要准备一定数量的培养皿或培养瓶。
在实验操作前，需要将培养皿或培养瓶进行消毒处理，以避免外源细菌的污染对实验结果的影响。
另外，还需要准备好相应的培养基和试剂，以及需要测定的病毒样品。
接下来，将培养皿或培养瓶按照实验要求进行编号，并分别加入适量的培养基。
然后，将待测病毒样品按照一定的稀释倍数进行稀释，并将不同稀释倍数的样品分别滴入已加入培养基的培养皿或培养瓶中。
在滴定完成后，将培养皿或培养瓶进行培养，培养时间根据不同病毒的特性而定，通常在37摄氏度下培养24-72小时。
培养结束后，观察培养皿或培养瓶中的细胞形态和数量，根据病毒感染的细胞数量和形态变化来确定病毒滴度。
通常情况下，病毒感染的细胞数量越多，病毒滴度越高。
在观察完毕后，可以根据所用的稀释倍数和感染细胞的数量来计算病毒的滴度。
除了上述介绍的常规方法外，还有一些改良的病毒滴度测定方法，如TCID50法、PFU法等。
这些方法在实际应用中有其特定的优势和适用范围，可以根据实际需求选择合适的方法进行病毒滴度测定。
总之，病毒滴度测定是病毒学研究和疫苗生产中不可或缺的重要实验方法之一。
通过本文的介绍，相信读者对病毒滴度测定方法有了更清晰的认识，希望能对相关领域的科研人员和生产工作者有所帮助。
病毒滴度测定
稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。
放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。
第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X 和Y，则滴度（TU/mL）=（X+Y×10）×1000/2/X 孔的病毒液的含量（μL）。
定量PCR 法病毒感染1 天前，取6 孔板接种HOS 细胞。
每孔细胞为5×100 000 个。
接种细胞24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5 μg/mL polybrene 的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200 倍，也就是取1 μL 病毒加入到199 μL 的培养基中。
在3 个培养孔中分别加入0.5 μL，5 μL 和50 μL 的稀释病毒。
感染开始后20 小时，除去培养上清，换为500 μL 含DNaseI 的新鲜培养基。
在37℃消化15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。
然后换为2 mL 正常的培养基，继续培养48 小时。
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(难点、重点)
计 出现CPE孔 所占的%
CPE孔数 无CPE孔数
10-1
10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
8
8 7 3 1
0
0 1 5 7
27
19 11 4 1
0
0 1 6 13
100（27/27）
100（19/19） 91.6 （11/12） 40（4/10） 0.7（1/14）
d：稀释系数，即组距
S：CPE(阳性)孔比率总和
d=lg10-1 = -1
lgCCID50=(-1) + (-1)×(3.375-0.5)
=-3.875
CCID50=10-3.875/0.1ml
ID50 和 LD50 的计算与CCID50完全相同(掌握)
lgCCID50=L+d(s-0.5)
ID50 LD50
Karber法计算CCID50
病毒液稀释度
10-1
(难点、重点)
出现CPE孔的比率
8/8=1
10-2
10-3
8/8=1
7/8=0.875
10-4
10-5
3/8=0.375
1/8=0.125
10-6
0/8=0
lgCCID50=L+d(s-0.5) L: 病毒的最低稀释倍数的对数 L=lg10-1 = -1
中性红
(熟悉)
(了解)
(了解)
空斑形成单位试验技术举例 p51-52 防止琼脂凝固； Hanks液？ 双抗？ 5% CO2
空斑形成单位的计算 (重点)
(掌握)
(熟悉)
(重点)
LD50
ID50
CCID50
(熟悉)
(熟悉)
5% CO2培养箱
(熟悉)
CCID50 TCID50
Reed-Muench法计算CCID50
病毒滴度的测定
空斑形成单位法测定病毒滴度
原理(重点)：适当稀释的病毒悬液与长成单 层的宿主细胞混合，在细胞上覆以营养琼脂培 养基等固体或半固体介质，由于琼脂的限制，
病毒只能感染并破坏临近的细胞，造成细胞溶
解而形成空斑，每个空斑由一个病毒颗粒造成，
计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的
病毒感染单位的浓度。 空斑形成单位（Plaque Forming Units, PFUs)
空斑形成单位法测定病毒滴度
空斑显现原理(掌握)：空斑形成后，经中性红 活细胞染色，活细胞显示红色，而空斑区细胞 不着色，形成不染色区域。
Procedures
空斑形成单位法测定病毒滴度
适用条件 (熟悉)：凡是能在细胞中产生细胞病 变效应 (CPE) 的病毒都可以采用空斑形成法测 定病毒滴度。
(掌握)
10 -6
0
8
0
21
0（0/21）
CPE(阳性)孔累计数由下向上累积 无CPE(阴性)孔累计数由上向下累积
CCID50
(难点、重点)
Calculation of TCID50
• Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well)
计算，S：感染比率总和； 计算，S：死亡比率总和；
(掌握)
血凝试验测定病毒滴度
血凝试验的基本原理(掌握)
红细胞凝集现象(血凝现象)
红细胞凝集抑制
(红细胞与抗体结合，失去血凝)
血凝滴度/血凝单位
干扰滴定测定病毒滴度
小结
主要介绍空斑形成单位法、50%终点法、血凝试 验和干扰滴定法测定病毒滴度的原理及其方法； 重点要掌握空斑形成单位法、50%终点法测定病 毒滴度的原理及其滴度的计算； 熟悉：空斑形成单位法、50%终点法、血凝试验 和干扰滴定法测定病毒滴度的具体方法；