查引物步骤-内部资料
引物相关知识点总结
引物相关知识点总结引物的选择引物的选择是PCR反应成功的关键之一，引物的选择会直接影响到PCR的特异性、敏感性和扩增效果。
引物的选择主要需要考虑以下几个方面：1. 引物的特异性引物必须与靶标的序列完全互补，不能与非靶标的序列发生杂交扩增。
因此，在选择引物时需要对靶标进行充分的序列比对，确保引物的特异性。
2. 引物的长度引物通常为20-25个核苷酸长，长度不宜太长或太短。
太短的引物可能导致杂交扩增，太长的引物会降低PCR的特异性。
3. 引物的G-C含量引物的G-C含量应在40%-60%之间，过高或过低的G-C含量都会影响引物的特异性和PCR扩增效果。
4. 引物之间的互补性引物之间的互补性要尽量避免，避免引物自身发生二聚体或多聚体，影响PCR扩增效果。
5. 引物的位置引物要尽可能选择在靶标序列内部，避免位于重复序列或其他非特异性区域，以提高PCR扩增的特异性。
6. 引物的富集引物的富集需要考虑引物之间的位置分布，避免引物聚集在同一区域，导致PCR扩增的偏倚性。
引物的设计引物的设计是引物选择之后的关键步骤，合理的引物设计能够提高PCR扩增的特异性和效率。
引物的设计主要需要考虑以下几个方面：1. 引物的序列比对在进行引物设计之前，需要对靶标进行充分的序列比对，确保引物与靶标的序列完全互补，具有良好的特异性。
2. 引物的避免区域在引物的设计过程中需要避开重复序列、低复杂度序列和其他非特异性区域，避免影响PCR扩增的特异性。
3. 引物的长度和G-C含量引物的长度和G-C含量需要根据靶标的序列特点进行合理设计，确保引物的特异性和PCR 扩增效果。
4. 引物的末端设计引物的末端设计需要尽量避免形成二聚体或多聚体，确保引物的稳定性和特异性。
5. 引物的交叉检验设计好的引物需要进行交叉检验，确保引物的特异性和效率。
引物的应用引物在分子生物学和生物技术领域有着广泛的应用，主要包括PCR、原位杂交、序列分析等。
下面将分别介绍引物在这些实验中的应用。
引物设计原理及详细步骤
2、引物长度一般在15-30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm 值5-10℃。
若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4、引物3'端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5、引物3'端不能选择A，最好选择T。
引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
6、碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal /mol）。
引物常识
引物的应用常识引物的原理引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3’-羟基由相配的引物提供。
在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。
在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
1. 不同实验要求的引物选择在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等）2.引物设计的重要因素有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。
引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。
引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。
目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，•引物长度和专一性常见的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。
较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。
同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。
•平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域引物的GC含量应介于40%～60%之间。
应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
primer操作流程
一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy 目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～5 00bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
引物验证方法
引物验证方法引物验证方法是一种用于检测和验证引物（primers）的有效性和特异性的实验方法。
在分子生物学和遗传学研究中，引物验证是非常重要的步骤，它可以帮助研究人员确定引物是否能够准确地扩增目标DNA序列，并排除非特异性扩增的可能性。
引物是在PCR（聚合酶链式反应）等核酸扩增技术中使用的短小的DNA或RNA片段，它们能够与待扩增的目标序列的两端互补结合。
引物的设计和验证对于确保实验结果的准确性至关重要。
引物验证的方法主要包括：1. 序列比对：将引物序列与目标DNA序列进行比对，确保引物与目标序列的互补性和特异性。
在进行引物设计之前，需要对目标序列进行仔细的分析和比对，以确保引物与非目标序列的互补部分的最小化。
2. 引物温度梯度PCR：通过PCR反应在不同的温度下进行，确定最适合引物扩增的温度范围。
在这个过程中，可以观察PCR扩增产物的强度和特异性，从而确定最佳的扩增温度。
3. 扩增产物测序：将扩增产物进行测序，验证是否与目标序列完全一致。
通过测序可以确定PCR扩增产物的准确性和特异性。
4. 引物效率实验：通过在不同浓度的DNA样本中进行PCR扩增，观察扩增产物的强度，以评估引物的扩增效率。
引物扩增效率越高，扩增产物的强度越高。
5. 引物特异性实验：在引物设计时，需要确保引物只与目标序列互补，不与其他非目标序列互补。
通过在不同的DNA样本中进行PCR反应，观察扩增产物的特异性，以验证引物的特异性。
6. 引物二聚体实验：引物二聚体是指引物之间的互相结合，形成二聚体的情况。
引物二聚体可能会导致PCR反应的特异性降低或失败。
通过进行引物二聚体实验，可以评估引物之间的结合情况，以保证引物的特异性。
引物验证方法的目的是确保引物的质量和特异性，为后续的实验提供可靠的基础。
在引物设计和验证的过程中，需要仔细选择和分析目标序列，使用适当的工具进行引物设计，并进行多种实验方法的验证。
只有通过严格的引物验证，才能确保实验结果的准确性和可靠性。
引物设计的详细步骤
一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer,进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
引物荧光标记检测方法
引物荧光标记检测方法
引物荧光标记检测方法是一种在分子生物学领域中广泛使用的技术。
本文将详细介绍这一方法的基本原理、操作步骤及其在各个领域的应用。
一、基本原理
引物荧光标记检测方法是基于聚合酶链反应（PCR）技术的一种改进方法。
在PCR过程中，通过将荧光染料标记在引物上，使得扩增的DNA产物带有荧光信号。
当PCR反应进行到一定阶段，荧光信号会随着DNA产物的增加而增强。
通过实时监测荧光信号的变化，可以判断目标DNA是否被成功扩增。
二、操作步骤
1.设计并合成带有荧光标记的引物；
2.配制PCR反应体系，包括模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶等；
3.在PCR仪上进行扩增反应，同时收集荧光信号数据；
4.分析荧光数据，判断目标DNA是否被成功扩增。
三、应用领域
1.基因检测：荧光标记引物可用于检测基因突变、基因型分析等；
2.疾病诊断：通过检测病原体DNA，实现对感染性疾病的快速诊断；
3.基因表达分析：荧光标记引物可用于定量分析基因表达水平；
4.法医学：用于DNA指纹鉴定、亲缘关系鉴定等；
5.环境监测：检测环境中的微生物、病原体等。
四、注意事项
1.选择合适的荧光染料和标记策略，以提高检测灵敏度和特异性；
2.优化PCR反应条件，确保荧光信号与DNA扩增同步；
3.防止荧光染料之间的相互干扰，影响检测结果；
4.针对不同的应用场景，选择合适的荧光检测设备和方法。
总之，引物荧光标记检测方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，在分子生物学研究和临床诊断等领域具有重要应用价值。
设计引物原则以及如何查找基因序列
引物设计原则：1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2.采用primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点：● 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应[2]。
● 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
● 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
● 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
● 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。
● 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。
●7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。
●8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
一步一步教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对等
一步一步教你使用NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对等最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在NCBI 上都可以方便的找到答案。
现在我就结合我自己使用NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下BCBI 的使用。
希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。
关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的IL6（白细胞介素6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html 在search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。
操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。
2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。
qPCR 引物篇(2)PCR 设计引物时如何查询基因
PCR 之引物设计--------基因序列查询篇•确定目标基因的形态：DNA or RNA•查找目标基因•比对目标基因同源性和特点•选取目标基因序列•选取目标基因的目标区段第一步：如何查基因：1、mRNA 序列的查询；以查大鼠cort为例；/search 选择11、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对象。
该mRNA文件的命名：Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA；NM_012835：是唯一的编号；把以下序列存成ｔｘｔ文件：Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA* Comment* Features* SequenceLOCUS NM_012835 438 bp mRNA linear ROD 11-FEB-2008DEFINITION Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA.ACCESSION NM_012835VERSION NM_012835.1 GI:6978682KEYWORDS .SOURCE Rattusnorvegicus (Norway rat)ORGANISM RattusnorvegicusEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Glires; Rodentia;Sciurognathi; Muroidea; Muridae; Murinae; Rattus.REFERENCE 1 (bases 1 to 438)AUTHORS Xidakis,C., Mastrodimou,N., Notas,G., Renieri,E., Kolios,G.,Kouroumalis,E. and Thermos,K.TITLE RT-PCR and immunocytochemistry studies support the presence ofsomatostatin, cortistatin and somatostatin receptor subtypes in ratKupffer cellsJOURNAL Regul.Pept. 143 (1-3), 76-82 (2007)PUBMED 17481746REMARK GeneRIF: RT-PCR and immunocytochemistry studies support the presence of cortistatin in rat Kupffer cells.REFERENCE 2 (bases 1 to 438)AUTHORS Bourgin,P., Fabre,V., Huitron-Resendiz,S., Henriksen,S.J., Prospero-Garcia,O., Criado,J.R. and de Lecea,L.TITLE Cortistatin promotes and negatively correlates with slow-wave sleepJOURNAL Eur. J. Neurosci. 26 (3), 729-738 (2007)PUBMED 17686045REMARK GeneRIF: The capacity of CST-14 to increase SWA, together with preprocortistatin's inverse correlation with time spent in SWS, suggests a potential role in sleep homeostatic processes.REFERENCE 3 (bases 1 to 438)AUTHORS Deghenghi,R., Avallone,R., Torsello,A., Muccioli,G., Ghigo,E. and Locatelli,V.TITLE Growth hormone-inhibiting activity of cortistatin in the ratJOURNAL J. Endocrinol. Invest. 24 (11), RC31-RC33 (2001)PUBMED 11817718REFERENCE 4 (bases 1 to 438)AUTHORS de Lecea,L., Criado,J.R., Prospero-Garcia,O., Gautvik,K.M., Schweitzer,P., Danielson,P.E., Dunlop,C.L., Siggins,G.R.,Henriksen,S.J. and Sutcliffe,J.G.TITLE A cortical neuropeptide with neuronal depressant andsleep-modulating propertiesJOURNAL Nature 381 (6579), 242-245 (1996)PUBMED 8622767COMMENT PROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet been subject to final NCBI review. The reference sequence was derived from U51919.1.Summary: inhibits growth hormone secretion; may act as aneuropeptide to mediate signaling via a somatostatin receptorsubtype [RGD].FEATURES Location/Qualifierssource 1..438/organism="Rattusnorvegicus"/mol_type="mRNA"/strain="Sprague-Dawley"/db_xref="taxon:10116"/chromosome="5"/map="5q36"gene 1..438/gene="Cort"/note="cortistatin"/db_xref="GeneID:25305"/db_xref="RATMAP:41189"/db_xref="RGD:2383"CDS 30..368/gene="Cort"/note="Preprocortistatin"/codon_start=1/product="cortistatin"/protein_id="NP_036967.1"/db_xref="GI:6978683"/db_xref="GeneID:25305"/db_xref="RATMAP:41189"/db_xref="RGD:2383"/translation="MGGCSTRGKRPSALSLLLLLLLSGIAASALPLESGPTGQDSVQDATGGRRTGLLTFLAWWHEWASQDSSSTAFEGGTPELSKRQERPPLQQPPHRDKKPC KNFFWKTFSSCK"sig_peptide 30..110/gene="Cort"mat_peptide 324..365/gene="Cort"/product="cortistatin-14"ORIGIN1 aaagcacagacttcaggtctccaaggaggatgggtggctgcagcacaagaggcaagcggc61 cgtcagccctcagtctgctgctgctgctgctgctctcggggatcgcagcctctgccctcc121 ccctggagagcggtcccaccggccaggacagtgtgcaggatgccacaggcgggaggagga181 ccggccttctgactttccttgcctggtggcatgagtgggcttcccaagacagctccagca241 ccgctttcgaagggggtaccccggagctgtctaagcggcaggaaagaccacccctccagc301 agcccccacaccgggataaaaagccctgcaagaacttcttctggaaaaccttctcctcgt361 gcaagtagcccgagcctgaccggagcctgaccggccaccctgtgaatgcagccgtggcct421 gaataaagagtgtcaagt//其中origin后面的序列，是我们用来设计的序列。
引物数据库帮助
引物数据库帮助1.高级查询 (1)2.限定词说明 (1)3.显示格式说明 (2)3.1.Summary显示格式 (2)3.2.Brief显示格式 (3)3.3.Primer显示格式 (3)4.数据提交 (4)4.1.提交步骤 (4)4.2.Primer文件格式说明 (5)4.3.数据格式范例 (6)5.附录 (7)5.1.引物设计原则 (7)2009年9月21日引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。
在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。
PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。
1.高级查询在首页上点击“数据库”按钮，选择“引物数据库”进入引物数据库主页。
在引物主页的左侧栏点击“高级检索”，进入如下图的高级检索页面：引物数据库提供了同时使用最多三个限定词的限定查询，以缩小查询的范围，可以使用的限定词包括CAC、Primer id、Application、Entry Date、Organism和Submitter Name等6种。
限定词之间由“AND”和“OR”连接，其中“AND”表示查询的结果中必须包含它所连接的两个关键词，“OR”表示查询的结果中至少包含它所连接的关键词中的一个。
此外，引物数据库还可以利用“限定年份”来进行时间段上的查询，依据是引物序列的最后修改日期，如果要查找在某一年修改过的引物序列，请在两个下拉选择表中选择相同的年份。
2.限定词说明引物数据库中有关的限定词说明如下表：限定词描述CAC引物在数据库中的唯一标识符Primer id引物提交时产生的流水号Application引物应用场景，如：基因克隆，ssr 标记，SNP 等Entry Date数据收录日期。
格式：YYYY/MM/DD (e.g.,1999/08/05)Organism物种学名Submitter Name 提交者姓名3.显示格式说明引物数据库的查询结果提供了三种显示格式：Summary 、Brief 和Primer 。
图解blast验证引物教程2
图中①代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分图中②代表这些序列与引物匹配的得分值位于40～50分图中③代表这些序列与引物匹配的得分值位于80～120分，分值越高，特异性越好。
线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。
图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。
没有连线的，表示单条引物与该基因一致。
点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。
（2）结果信息概要：Accession、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息Desscription、系列的简单描述Total score高的就是有两线段间有连线的，如图划线的。
E value：代表被比对的两个序列不相关的可能性。
【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。
E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。
设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：U代表：Unigene数据库E代表：GEO profiles数据库G代表：Gene数据库（3）结果详细信息：划线上代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：划线下代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况：共有20个碱基匹配，得分40.1分【20×2＋0.1＝40.1】，E值为0.077。
为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种？A、为同一个基因来源的不同的mRNA片段B、为该基因的DNA系列C、为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。
结果判断：①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。
引物设计
查找引物的几种途径•1：引用高影响因子的文献。
•2：在线设计软件。
•3：一些引物库。
•4：引物设计软件。
如Primer，Oligo，DNA star等。
/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgihttp://medgen.ugent.be/rtprimerdb//primerbank/引物设计的步骤•1：PUBMED查找目的基因序列。
•2：软件查找引物。
•3：按照实验要求修饰引物。
•4：在PUBMED上BLAST分析同源性。
引物设计的原则•1：引物的长度（primer length）。
•2：产物的长度（product length）。
•3：引物的3’端和5’端。
•4：引物序列的GC含量（GC composition）。
•5：引物的二聚体和发夹结构（duplex formation and hairpin）。
•6：引物的Tm值。
•7：错误引发位点（false priming site）•8：引物的特异性1：PUBMED查找目的基因序列c DNA序列DNA 序列点击CDS后得到cDNA序列2：软件查找引物自动搜索功能引物分析功能符合要求的引物查询引物酶切位点引物自身形成发夹结构引物自身形成二聚体引物之间形成二聚体结果保存3：引物的修饰4：BLAST分析同源性/blast/Blast.cgi填入引物序列选择种属表明上游引物与这些序列匹配的得分在40分以下mRNA基因组表明引物序列与转录mRNA和基因组的匹配度提供一些同源性的具体信息•1：引物的长度一般为16-30bp，一般比较常用的是18-27bp，长度太短容易导致产物的特异性不高，导致非特异性产物。
引物长度大于38会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
•2：产物长度为300~600碱基对，过小则不容易和引物二聚体区分开，不利于后面的实验。
而过长一方面增加错配的几率，一方面会增加延伸时间。
•3：引物的3’端和5’端。
实验三 基因序列查找及PCR引物设计
三、基因序列查询
BCBI（美国国立生物信息中心） 主页： / Mapview： /mapview/ind ex.html
四、引物设计
引物设计有3条基本原则：
1、引物与模板的序列要紧密互补
抄在实验报告上，标明基因名称、基因编号。
2、利用Primer5 软件设计一对与你查询基因 序列相应的PCR扩增引物。
是利用DNA片段旁侧两个短的 单 链 引 物 ， 在 体外快 速扩增特 异 DNA片段的技术。
PCR基本原理
反应材料
模板DNA
引物对
按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计；
DNA聚合酶：耐高温
Taq DNA polymerase、Pfu DNA polymerase
dNTP 缓冲液溶液
2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹 结构
3、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反 应(即错配)
引物设计考虑的主要因素 1、引物长度：一般18-24个碱基对 2、相似性较高序列
3、引物二聚体或发夹结构
4、引物序列的GC含量：一般为40-60%
五、作业 1、在NCBI上查找一段基因序列，将碱基序列
Mg2+, Tris缓冲液溶液等
PCR反应步骤
DNA解链（变性）
引物与模板 DNA 相结合（退火） DNA合成（延伸）
引物设计的详细步骤
引物设计的详细步骤引物设计是一项关键的实验技术，用于在分子生物学实验中扩增目标DNA片段。
该技术的成功与否直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
以下是引物设计的详细步骤：1.确定目标DNA序列：首先，确定需要扩增的目标DNA序列。
这可以通过已知的参考序列、文献调研或基因数据库进行。
2.定位扩增区域：根据目标DNA序列，确定需要扩增的特定区域。
通常选择在该区域中的保守性较高的片段，以确保引物的特异性。
3. 确定引物长度：引物长度通常为18-25个核苷酸（nt），最好不超过30nt。
引物长度的选择是为了确保引物在反应温度下的特异性和稳定性，同时不会引起非特异扩增。
4.碱基组成与G/C含量：引物的碱基组成应平衡，避免过多的同质二聚物和结构异常。
G/C含量一般在40-60%之间，过高或过低的G/C含量可能会导致引物与模板DNA结合的效力降低。
5.特异性：使用基因序列数据库或引物设计软件进行引物BLAST比对，确保引物与目标DNA序列的独特性。
6. 避免互补引物间的二聚体形成：引物间不能有太多相互衔接的序列，以免引物自身形成二聚体。
通常应避免引物间的结合自由能低于-9 kcal/mol。
7.避免引物内部二聚体的形成：通过引物设计软件计算引物的内部二聚体结合自由能，避免过多的二聚体形成。
8.引物末端设计：通常引物的末端应设计在较保守的区域，以确保扩增的特异性。
9.引物的副产物与杂交：避免引物自身产生副产物以及与其他非特异目标DNA序列杂交。
10.引物设计验证：使用引物设计软件对设计的引物进行验证，包括引物特异性、二聚体和杂交等。
11.引物合成：通过合成引物的商业公司进行引物合成，选择信誉好的厂家。
12.引物纯化：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对引物进行纯化。
13.引物浓度测定：使用紫外分光光度计等方法测定引物的浓度。
总之，引物设计是一项细致而复杂的步骤，需要考虑多个因素，如目标DNA序列，引物长度，碱基组成，特异性和二聚体等。
如何查找基因的基本信息(编码区,引物设计等)
引物设计原则：1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2.采用primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点：● 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应[2]。
● 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
● 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
● 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
● 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。
● 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。
●7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。
●8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
引物设计的详细步骤
引物设计的详细步骤引物设计步骤如下：1.目标序列选择：根据研究目的选择需要扩增或检测的目标DNA序列。
这个目标序列可能是基因的特定区域、启动子区域、外显子、cDNA序列等。
选择一个合适的目标序列对于引物设计至关重要，因为它将决定引物的特异性和扩增产物的大小。
一般而言，目标序列具有良好的保守性和特异性。
2.引物长度和Tm计算：引物通常是15-30个核苷酸长度。
引物长度的选择取决于目标序列的特点以及所使用的实验条件。
合适的引物长度应该综合考虑引物的特异性和扩增效率。
引物的熔解温度（Tm）是指DNA链的两个链断裂开所需要的温度，它是引物设计中一个重要的参数。
Tm可以通过计算引物的碱基组成、盐度和引物浓度等因素来估计，通常约为55-65℃。
3. 引物特异性检查：使用生物信息学工具，如BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）或NCBI（National Center forBiotechnology Information）数据库来检查所设计引物的特异性。
确保引物不会扩增与目标序列不匹配的区域，避免非特异性扩增和假阳性结果。
4.引物序列设计：根据目标序列和引物长度选择合适的引物序列。
引物设计的要求包括：GC含量约为40-60%、避免重复序列和目标序列内部的局部重复、避免碱基偏差和突变等。
此外，引物的碱基组成应该是均匀的，避免多个连续G或C碱基的存在。
6.引物的合成：将设计好的引物交给合成公司进行合成，通常采用化学合成方法。
引物的质量控制非常重要，合成的引物应进行质控检测，如毛细管电泳或质谱分析。
推荐文献：2. Untergasser A, et al. (2024) Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40(15): e115.。
引物设计是分子生物学研究中必不可少的技术之一、通过遵循上述步骤和参考推荐文献，可以设计出特异性高、效率好的引物，为后续实验的顺利进行提供支持。