CLSI临床微生物实验室标准解1

CLSI临床微生物实验室标准解读

葡萄球菌

CLSI 临床微生物实验室标准解读第一辑

2009年CLSI (M100-S19)中葡萄球菌属药敏更新部分

中国医学科学院北京协和医院王辉陈宏斌

2009年CLSI在版式上的显著变化是将K-B法和MIC法放在同一个表格中，方便比较。对于葡萄球菌属，主要有以下更新和变化：一是去除凝固酶阴性葡萄球菌苯唑西林纸片扩散法试验；二是删除了万古霉素纸片扩散法的药敏折点；三是增加了金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的检测。

一、β-内酰胺类的变化

2009年CLSI指出在报告青霉素对葡萄球菌敏感之前，即当MIC≤0.12μg/ml或抑菌圈直径≥29 mm，需要做可诱导的β-内酰胺酶试验。其操作如下：将分离菌株传种至血平皿或MH琼脂上，贴上作为诱导子的苯唑西林或头孢西丁纸片，35℃孵育16-18h，挑取抑菌圈边缘的细菌做b-内酰胺酶试验。b-内酰胺酶试验阳性可以预测青霉素、氨苄西林、阿莫西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林和哌拉西林耐药。

在检测MRS时，金葡菌、路登葡萄球菌和其它凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)对苯唑西林的折点和选取的药敏方法有所不同，具体见表1(见下页)。在CoNS(除外路登葡萄球菌以外)中，由于苯唑西林纸片扩散法存在太多假―R‖，所以此法被去除，而是采用头孢西丁纸片法、苯唑西林/头孢西丁MIC法检测mecA介导的苯唑西林耐药。

对于由CoNS(除外表皮葡萄球菌)引起的严重感染，当苯唑西林MIC值在0.5-2μg/mL之间时，应当检测该菌株是否产mecA基因或PBP2a(图1)。利用头孢西丁检测mecA 介导的苯唑西林耐药所推荐的质控菌株是金葡菌ATCC25923-mecA阴性(抑菌圈直径23-29mm)和金葡菌ATCC43300-mecA阳性(抑菌圈直径≤21mm)。

图1 CoNS*苯唑西林MIC结果报告策略

二、糖肽类耐药性的检测

2009年CLSI推荐采用MIC法检测所有葡萄球菌对万古霉素的敏感性，去除了纸片扩散法。这是因为纸片扩散法不能区分万古霉素敏感、中介耐药的葡萄球菌。图2显示采用Etest测定万古霉素对金葡菌的MIC为8mg/ml，为―I‖，而采用纸片扩散法，抑菌圈直径为17mm，为―S‖。万古霉素纸片扩散法仅仅对于检测含vanA的金葡菌(VRSA)是可靠的。如果抑菌圈直径≥7mm，需要检测万古霉素的MIC值。对万古霉素MIC值升高的金葡菌(MIC ≥4mg/mL)和CoNS(MIC≥8mg/mL)需要送往参考实验室进一步确证。目前的研究没有重新评估替考拉宁纸片扩散法的折点，因此纸片扩散法能否将替考拉宁中介、耐药的葡萄球菌与敏感的菌株区分开来还不清楚。

2009CLSI明确指出采用含6mg/ml万古霉素脑心浸液(BHI)琼脂筛选万古霉素MIC≥8mg/ml 的金葡菌，具体步骤如下：制备含6mg/ml万古霉素脑心浸液(BHI)琼脂，将待测菌株调整到0.5麦氏单位菌悬液，用加样枪吸取10ml菌悬液点种到制备好的琼脂板上，或者是用菌悬液浸湿棉签并拧干多余的液体，在制备好的琼脂板上点种直径10-15mm的面积，35±2℃空气孵育24小时，>1个菌落或薄膜生长即可推测为万古霉素敏感性下降金葡菌。进一步的试验是用确证的MIC方法检测在筛选平皿上生长金葡菌对万古霉素的MIC值。BHI琼脂筛选法不能稳定地检测所有万古霉素中介金葡菌，一些万古霉素MIC为4mg/ml的金葡菌不能在

琼脂板上生长。推荐的质控菌株是粪肠球菌A TCC29212(敏感)和粪肠球菌ATCC51299(耐药)。

异质性万古霉素中介金葡菌(hVISA)是指子代中含万古霉素MIC值8-16mg/ml的细胞，大多数发生于万古霉素治疗的病人，hVISA可能造成万古霉素治疗失败。采用标准的万古霉素MIC试验，一些hVISA的MIC值在1-2mg/ml之间，CLSI中还没有检测hVISA的特异方法。

图2 采用CLSI M100-S18万古霉素纸片扩散法折点，将―I‖金葡菌错误地判断为―S‖(此图片来自Janet Hindler教授的幻灯片)

三、达托霉素药敏试验

CLSI规定采用肉汤稀释法检测达托霉素MIC值，使用的培养基是CAMHB，需要将Ca2+调整至50mg/mL。葡萄球菌属对达托霉素的MIC折点只定义敏感范围(≤1mg/mL)，目前没有中介和耐药的折点。菌株MIC值高于敏感折点被定义为不敏感(nonsusceptible)。实验室如果碰到达托霉素不敏感株，需要重新鉴定菌株和检测药敏，然后送往参考实验室进一步确认。2009年CLSI指出纸片扩散法检测达托霉素不可靠，琼脂稀释法用于达托霉素还没有被批准。四．金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的筛选

莫匹罗星属于pseudomonic acid类抗生素，主要用于皮肤感染(如脓疱病)治疗和金葡菌鼻腔定植的清除，不需要常规检测药敏，仅仅在特别必要时检测。2009年CLSI提出要筛选金葡菌对莫匹罗星的高水平耐药(见表2)。研究表明莫匹罗星对金葡菌MIC≥512mg/mL，与定植不能清除相关。虽然此文件没有定义莫匹罗星敏感性的具体折点，但纸片扩散法和MIC筛选法可以鉴定莫匹罗星MIC值≥512mg/mL菌株。

链球菌

CLSI 临床微生物实验室标准解读第二辑

CLSI的链球菌属药敏解读

北京协和医院杨启文王辉

对于链球菌属，CLSI将药敏分为3个部分：肺炎链球菌的药敏解读、b溶血链球菌的药敏解读和草绿色链球菌的药敏解读。不用的菌种CLSI有不同的规定，现对链球菌属的CLSI 药敏作逐一解读：

1. 肺炎链球菌：

(1) 肺炎链球菌对青霉素和其他b内酰胺类药物的敏感性检测

CLSI对该组合的解释标准按照感染类型和给药途径不同分为三类(表1)，3种情况均有不同的折点。

对于非脑膜炎的青霉素静脉给药治疗，CLSI认为对于青霉素MIC≤2µg/ml的菌株，肾功正常的成年人，应每次至少应用200万单位，每四小时给药一次（每天1200万单位）的方式进行治疗。对于MIC为4µg/ml的菌株则须将剂量提高至每天1800-2400万单位。对于非脑脊液标本中分离出的肺炎链球菌，需同时使用脑膜炎和非脑膜炎的折点来报告青霉素的敏感性。

对于脑膜炎的青霉素静脉给药治疗，CLSI 认为需将青霉素用量提高至最大(如肾功正常的成年人可使用每次300万单位，每四小时一次的给药方式)。对于脑脊液中分离的肺炎链球菌，仅需采用脑膜炎的折点报告青霉素的敏感性。

常规工作中可以用含5%脱纤维羊血的Mueller-Hinton平皿进行苯唑西林的纸片扩散法来检测青霉素的敏感性。苯唑

西林的抑菌圈直径≥20mm时，可以判定青霉素为敏感(相当于青霉素的MIC≤0.06mg/ml)。但纸片扩散法不能用于区分耐药菌株和低耐菌株，因此抑菌圈直径≤19mm的菌株可能是青霉素耐药或中介甚至是敏感的菌株，对于这些菌株应该进行肉汤或琼脂稀释试验测定青霉素的MIC。需要注意的是，苯唑西林纸片扩散法是用来预测青霉素敏感性的，苯唑西林MIC 本身无价值，因此无需测定苯唑西林的MIC。

对于非脑膜炎的菌株，青霉素的MIC可以预测下列β内酰胺类药物的敏感性：青霉素MIC≤0.06mg/ml(或苯唑西林

抑菌圈直径≥20mm)提示菌株对氨苄西林(口服或肠外)、氨苄西林-舒巴坦、头孢克罗、头孢地尼、头孢妥仑、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢唑肟、头孢呋辛、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南也敏感；青霉素MIC≤2µg/ml提示菌株对阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和厄他培南也敏感。