LC-NMR原理和发展历程ppt课件
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二、HPLC-NMR的发展进程
• 在70年代末，第一次有人将HPLC-NMR联 用
• 80年代末HPLC-NMR技术才作为一种有效 的分析手段而得到了承认
• 最近几年HPLC-NMR的分析方法迅速发展 并取得了巨大的成功，已经被证明为生物 化学和药物化学分析中最重要的分子结构 鉴定方法之一
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三、HPLC-NMR的装置
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• NMR探头是联用装置中最关键的部分。传统的NMR探头样品管在一 个与测量线圈相连的玻璃插件内旋转。
• HPLC-NMR探头由一个不旋转的直接固定在射频线圈上的玻璃管构成， 它处于传统探头玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管内径为2，3或4 mm。玻 璃壁长度至少超过质子检测线圈(18 mm)，并与之平行，同时向两端 逐渐变细。由于射频线圈直接固定在检测池的玻璃管上，NMR线圈的 体积与试样体积比，即所谓的填充因子(filling factor)接近最佳值，这 种类型的NMR测定探头原则上是最灵敏的。
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（1）连续流动模式 • HPLC的流动是连续的，不受NMR取样的
影响，当每一组分由HPLC流经NMR检测 池时仪器时就会扫描出这个组分的谱图。 使用这种方法可以在很短的时间内完成样 品分析并得到各组分分子结构方面的信息。 因此连续流操作方式在一些要求较快得出 检测结果的分析中得到了应用。但是这种 模式一般只适用于 1H和 19F测试。
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四、HPLC-NMR在实际应用中面临 的主要技术问题及解决方法
（一）HPLC高浓度溶剂的NMR信号抑制 • 首先，大多数HPLC体系采用反相柱，两元
或三元体系作为流动相，这些强溶剂峰使 得被分析成分的NMR信号变差，且强的溶 剂峰所伴随的13C 卫星峰也会干扰有用信号 的观测。
• 其次，实验过程中流动相溶剂梯度会引起 某些溶剂峰化学位移的移动。
• 与HPLC的常规用量相比，NMR检测所需的样品 量是非常大的。在HPLC-NMR操作中，较大的 HPLC进样量和较长的HPLC流动时间实际上造成 了色谱峰的展宽。
• 理想的进样量应该是尽可能小地来取得好的 HPLC分辨率，同时又应该尽可能大地来满足 NMR检测的需要。这个问题可以通过选择最佳进 样量及优化其它操作条件来部分地解决。
• 典型的HPLC—NMR联用装置是由泵、注入阀、色谱柱和紫外检测器组 成LC系统，通过一条2～2 .5m长的特制毛细管连接到NMR液相探头上。 可以将NMR 视为HPLC 的特殊检测器，其化学位移、积分强度和谱线 分裂情况能提供丰富的定量定性信息。位于NMR探头底部的阀用来控 制NMR测试是在停流状态下还是在连续流动状态下进行。
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（2）驻流模式：
• 驻流模式：让溶液停留于检测池中进行测试，当所需要组 分的保留时间已知，或者HPLC—NMR采用灵敏的在线检 测器时，可以采用这种方法。 ①时间分割驻流方式。这是最早使用的一种驻流操作方式。 具体方法是：通过紫外检测器确定了色谱峰位置之后，在 适当的时间停止色谱流动，使色谱峰准确地停留在NMR 检测池中，同时使用NMR进行较长时间的扫描(可达数小 时)，并且根据需要可以作COSY、TOCSY等二维NMR谱 图。一个谱峰扫描完毕后，可以继续色谱流动。这样就相 当于将整个色谱流动过程分为若干段，一段段地进行 NMR分析。
(2)使用高频仪器。 随着NMR技术的发展，仪器的频率在不断的提 高，现在已出现了800MHz以上的仪器，灵敏度较 以往的仪器有了大幅度的提高。
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(3)利用SPC等方法浓缩样品
• 超临界流体是指处于临界温度、临界压源自文库状态下 的物质，这时其物理性质介于气体和液体之间。 超临界流体技术能够弥补气相和液相分离存在的 缺点，且能兼顾两者的优点。
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(4)降低探头温度 利用高温超导薄膜材料而制成的超导低温探 头，当样品温度由温控单元维持时，采用闭 环或开环制冷系统使超导线圈温度降到25K， 消除了谱图的电噪声，这相对于常规5 mm 探头而言，其潜在灵敏度可以提高8～10倍。
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五、操作模式和技术
• 总的来看，目前HPLC-NMR主要有两种可 供选择的操作方式，分别是连续流方式和 驻流方式。其中驻流方式又主要分为时间 分割驻流方式、脱机驻流方式和uv检测自 动控制NMR取样。下面对其进行一一详细 讨论。
• 作为流动相的CO2具有价廉、安全和易获取等优点， 对低极性或中极性物质具有较好的溶解性，适合 分析热敏感组分 。同时，作为流动相的CO2 没有 氢信号，因而不需要考虑水峰抑制问题。可以一 次性完成从样品的分离纯化到蜂的检测、结构测 定和定量分析，并提供混合物的组成和结构信息， 从而提高了研究效率和灵活性。
HPLC-NMR联用技术
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目录
一、HPLC-NMR出现的意义 二、HPLC-NMR的发展进程 三、HPLC-NMR装置 四、HPLC-NMR在实际应用中面临的主要技
术问题及解决方法 五、操作模式和技术 六、HPLC-NMR的应用 七、HPLC-NMR的前景展望
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一、HPLC-NMR出现的意义
• 高效液相色谱是分析复杂有机物、药物和生物大分子等混 合物的一种重要手段,但如果使用通常的检测器如紫外、 荧光、电化学等检测器只能得到非常有限的分子结构信息。
• NMR能够提供大量的分子结构信息，但NMR分析方法要 求样品为纯品，对于复杂的混合物，因为NMR信号的互 相覆盖，单纯靠NMR谱则显得无能为力。
如果在核磁仪器前加上一级色谱分离设备把直接样品分离 后再送人NMR中扫描，就可以大大简化分析程序，提高 样品分析速度，这就是色谱分离技术与NMR波谱仪结合 并且日趋普及的原因。
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（三）NMR高灵敏度的需要 NMR的灵敏度大大低于HPLC的其它常规检测器 (如：紫外检测器等)灵敏度，如何解决这个矛盾是 HPLC-NMR技术发展的主要难题之一。高场探头 性能的不断改进，大大提高了NMR的检测灵敏度， 除此外，目前还可采取四个个途径：
(1)采取适当的操作方式。（后续讲述） 例如采用驻流方式可以大大提高系统的灵敏度。
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常用的方法有： • 采用氘代溶剂，价格昂贵，但近年来由于
毛细管HPLC的发展，溶剂的消耗量大为减 少，实验中有可能使用氘代试剂作洗脱液， 不必使用溶剂抑制。 • 通过不同频率通道进行多重溶剂峰预饱和。 • 脉冲梯度场的相位离散而消除溶剂干扰。 • 使用WET-序列。
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（二） 避免损害色谱分析的分辨率
二、HPLC-NMR的发展进程
• 在70年代末，第一次有人将HPLC-NMR联 用
• 80年代末HPLC-NMR技术才作为一种有效 的分析手段而得到了承认
• 最近几年HPLC-NMR的分析方法迅速发展 并取得了巨大的成功，已经被证明为生物 化学和药物化学分析中最重要的分子结构 鉴定方法之一
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三、HPLC-NMR的装置
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• NMR探头是联用装置中最关键的部分。传统的NMR探头样品管在一 个与测量线圈相连的玻璃插件内旋转。
• HPLC-NMR探头由一个不旋转的直接固定在射频线圈上的玻璃管构成， 它处于传统探头玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管内径为2，3或4 mm。玻 璃壁长度至少超过质子检测线圈(18 mm)，并与之平行，同时向两端 逐渐变细。由于射频线圈直接固定在检测池的玻璃管上，NMR线圈的 体积与试样体积比，即所谓的填充因子(filling factor)接近最佳值，这 种类型的NMR测定探头原则上是最灵敏的。
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（1）连续流动模式 • HPLC的流动是连续的，不受NMR取样的
影响，当每一组分由HPLC流经NMR检测 池时仪器时就会扫描出这个组分的谱图。 使用这种方法可以在很短的时间内完成样 品分析并得到各组分分子结构方面的信息。 因此连续流操作方式在一些要求较快得出 检测结果的分析中得到了应用。但是这种 模式一般只适用于 1H和 19F测试。
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四、HPLC-NMR在实际应用中面临 的主要技术问题及解决方法
（一）HPLC高浓度溶剂的NMR信号抑制 • 首先，大多数HPLC体系采用反相柱，两元
或三元体系作为流动相，这些强溶剂峰使 得被分析成分的NMR信号变差，且强的溶 剂峰所伴随的13C 卫星峰也会干扰有用信号 的观测。
• 其次，实验过程中流动相溶剂梯度会引起 某些溶剂峰化学位移的移动。
• 与HPLC的常规用量相比，NMR检测所需的样品 量是非常大的。在HPLC-NMR操作中，较大的 HPLC进样量和较长的HPLC流动时间实际上造成 了色谱峰的展宽。
• 理想的进样量应该是尽可能小地来取得好的 HPLC分辨率，同时又应该尽可能大地来满足 NMR检测的需要。这个问题可以通过选择最佳进 样量及优化其它操作条件来部分地解决。
• 典型的HPLC—NMR联用装置是由泵、注入阀、色谱柱和紫外检测器组 成LC系统，通过一条2～2 .5m长的特制毛细管连接到NMR液相探头上。 可以将NMR 视为HPLC 的特殊检测器，其化学位移、积分强度和谱线 分裂情况能提供丰富的定量定性信息。位于NMR探头底部的阀用来控 制NMR测试是在停流状态下还是在连续流动状态下进行。
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（2）驻流模式：
• 驻流模式：让溶液停留于检测池中进行测试，当所需要组 分的保留时间已知，或者HPLC—NMR采用灵敏的在线检 测器时，可以采用这种方法。 ①时间分割驻流方式。这是最早使用的一种驻流操作方式。 具体方法是：通过紫外检测器确定了色谱峰位置之后，在 适当的时间停止色谱流动，使色谱峰准确地停留在NMR 检测池中，同时使用NMR进行较长时间的扫描(可达数小 时)，并且根据需要可以作COSY、TOCSY等二维NMR谱 图。一个谱峰扫描完毕后，可以继续色谱流动。这样就相 当于将整个色谱流动过程分为若干段，一段段地进行 NMR分析。
(2)使用高频仪器。 随着NMR技术的发展，仪器的频率在不断的提 高，现在已出现了800MHz以上的仪器，灵敏度较 以往的仪器有了大幅度的提高。
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(3)利用SPC等方法浓缩样品
• 超临界流体是指处于临界温度、临界压源自文库状态下 的物质，这时其物理性质介于气体和液体之间。 超临界流体技术能够弥补气相和液相分离存在的 缺点，且能兼顾两者的优点。
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(4)降低探头温度 利用高温超导薄膜材料而制成的超导低温探 头，当样品温度由温控单元维持时，采用闭 环或开环制冷系统使超导线圈温度降到25K， 消除了谱图的电噪声，这相对于常规5 mm 探头而言，其潜在灵敏度可以提高8～10倍。
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五、操作模式和技术
• 总的来看，目前HPLC-NMR主要有两种可 供选择的操作方式，分别是连续流方式和 驻流方式。其中驻流方式又主要分为时间 分割驻流方式、脱机驻流方式和uv检测自 动控制NMR取样。下面对其进行一一详细 讨论。
• 作为流动相的CO2具有价廉、安全和易获取等优点， 对低极性或中极性物质具有较好的溶解性，适合 分析热敏感组分 。同时，作为流动相的CO2 没有 氢信号，因而不需要考虑水峰抑制问题。可以一 次性完成从样品的分离纯化到蜂的检测、结构测 定和定量分析，并提供混合物的组成和结构信息， 从而提高了研究效率和灵活性。
HPLC-NMR联用技术
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目录
一、HPLC-NMR出现的意义 二、HPLC-NMR的发展进程 三、HPLC-NMR装置 四、HPLC-NMR在实际应用中面临的主要技
术问题及解决方法 五、操作模式和技术 六、HPLC-NMR的应用 七、HPLC-NMR的前景展望
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一、HPLC-NMR出现的意义
• 高效液相色谱是分析复杂有机物、药物和生物大分子等混 合物的一种重要手段,但如果使用通常的检测器如紫外、 荧光、电化学等检测器只能得到非常有限的分子结构信息。
• NMR能够提供大量的分子结构信息，但NMR分析方法要 求样品为纯品，对于复杂的混合物，因为NMR信号的互 相覆盖，单纯靠NMR谱则显得无能为力。
如果在核磁仪器前加上一级色谱分离设备把直接样品分离 后再送人NMR中扫描，就可以大大简化分析程序，提高 样品分析速度，这就是色谱分离技术与NMR波谱仪结合 并且日趋普及的原因。
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（三）NMR高灵敏度的需要 NMR的灵敏度大大低于HPLC的其它常规检测器 (如：紫外检测器等)灵敏度，如何解决这个矛盾是 HPLC-NMR技术发展的主要难题之一。高场探头 性能的不断改进，大大提高了NMR的检测灵敏度， 除此外，目前还可采取四个个途径：
(1)采取适当的操作方式。（后续讲述） 例如采用驻流方式可以大大提高系统的灵敏度。
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常用的方法有： • 采用氘代溶剂，价格昂贵，但近年来由于
毛细管HPLC的发展，溶剂的消耗量大为减 少，实验中有可能使用氘代试剂作洗脱液， 不必使用溶剂抑制。 • 通过不同频率通道进行多重溶剂峰预饱和。 • 脉冲梯度场的相位离散而消除溶剂干扰。 • 使用WET-序列。
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（二） 避免损害色谱分析的分辨率