琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化

实验三琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化

一、实验目的

1、掌握琼脂糖凝胶制备方法

2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA方法

3、掌握PCR产物回收和纯化方法

二、实验原理

根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

电泳过程中或电泳完毕，直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙锭）进行染色，EB可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出荧光，既可以确定DNA条带在凝胶中的位置，而且灵敏度很高，少至1～10 ng的DNA 条带即可直接在紫外灯下检出。

不同浓度琼脂糖凝胶分离的范围

琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。试剂盒

中有一个特制的Column，将硅胶填充到这个特制的管中，利用硅胶在高盐低pH 下，吸附DNA，在低盐和高pH条件下DNA可再被洗脱的原理，进行DNA 的回收和纯化。

此外还有玻璃奶（Glassmilk法），冻融法等方法回收纯化DNA。

三、主要实验仪器和试剂

主要仪器：

电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。

主要实验试剂:

1、50×TAE （2 M Tris，1M 醋酸，50 mM EDTA（pH8.0））

2、10×上样缓冲液（loading buffer）

3、分子量标准DNA Marker

4、琼脂糖

5、EB （溴化乙锭）（黑暗保存）

6、DNA回收纯化试剂盒（AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒）

四、实验步骤

琼脂糖凝胶的制备：

1、将洗净的电泳槽洗净，置于平整的台面上，并调节水平；

2、用1×TAE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使其溶解；

3、待琼脂糖溶液冷却至60°C左右时，加入EB（浓度约0.025 ug/mL）,

搅拌均匀。缓缓将琼脂糖倒入胶模中，厚度约5至7mm；

4、插入梳子，静待琼脂糖凝固；

5、将胶模放进电泳槽中，向电泳槽倒入1×TAE电泳缓冲液，没过胶约

5mm；

6、小心拔掉梳子，用20 ul移液器吸取DNA溶液（20 ul DNA 加2～3ul 10

×loading buffer），缓缓加入点样孔；并在最右边的点样孔加4 ul DNA Maker；

7、接通电源，（注意电源的正负极！）电泳20～30分钟；

8、电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，置于紫外灯下观察。PCR产物切胶回收：

1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量。（100mg

凝胶，计100ul体积）（尽量缩短暴露UV灯下的时间！）

2、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A（600 ul），混合均匀后，于65°C 加

热，直至凝胶完全熔化。

3、加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B（300 ul）,混合均匀，当分离

的DNA片段小于400 bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。

4、吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml 离心管中），12，

000×g 离心1 min。弃滤液。

5、将制备管置回2 ml离心管中，加500 ul Buffer W1，12，000×g 离心

30 sec，弃滤液。

6、将制备管置回2 ml离心管中，加700 ul Buffer W2, 12，000×g 离心30

sec，弃滤液。重复一次。

7、将制备管置回2 ml离心管中，12，000×g 离心1 min。彻底去除残余

的液体。

8、将制备管置于1.5 ml离心管中，在制备膜中央，加25～30 ul 65°C Eluent

或去离子水，室温静置1 min。12，000×g 离心1 min洗脱DNA。

思考题：

1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？

2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

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