IL-35诱导中性粒细胞N2表型极化促进肿瘤生长

IL-35诱导中性粒细胞N2表型极化促进肿瘤生长目的:IL-35是新近发现的具有促肿瘤生长和转移作用的细胞因子,研究显示IL-35能够诱导调节性T细胞产生抑制抗肿瘤免疫应答,然而在缺乏成熟T、B淋巴细胞的Rag1/2-/-小鼠体内过表达IL-35也能促进肿瘤的生长和转移。因此,这意味着IL-35也可能通过调控先天性免疫细胞功能发挥促瘤作用。中性粒细胞在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用,一方面可以通过释放细胞毒性物质来破坏肿瘤细胞,另一方面,炎性因子诱导的中性粒细胞N2极化又能够促进肿瘤的发生发展。本研究旨在探讨IL-35是否能够通过影响中性粒细胞极化进而影响肿瘤的发生发展。方法:(1)通过肌肉注射转染pIL-35质粒制备体内表达IL-35小鼠模型,然后接种H22或B16F0肿瘤细胞,10天后取外周血及剥离肿瘤,流式细胞分析外周血和肿瘤组织中性粒细胞数量,实时荧光定量PCR检测肿瘤组织内中性粒细胞趋化因子CXCL1,CXCL2,CXCL5,CXCL15,CCL2,CCL3,CCL4,CCL5 和 VEGF 表达,探讨IL-35对小鼠骨髓中性粒细胞动员及在肿瘤微环境募集的影响及机制。(2)进一步分析IL-35是否能够通过影响中性粒细胞极化促进肿瘤生长,在正常对照、pUN01空载质粒对照、pIL-35实验组小鼠采用转染pCXCL1质粒的方式在肿瘤接种部位募集中性粒细胞,并观察募集的中性粒细胞对小鼠肿瘤生长的影响。在混合接种试验中,采用Percoll密度梯度离心法分离小鼠骨髓及腹腔来源的中性粒细胞,然后与肿瘤细胞混合接种,10天后剥离肿瘤称取瘤重以评价中性粒细胞对肿瘤生长的影响。(3)采用免疫组化和免疫荧光的方法检测肿瘤

组织新生血管形成;流式细胞分析体外骨髓中性粒细胞对抗CD3/CD28激活的脾脏T细胞增殖的影响;实时荧光定量PCR检测骨髓及腹腔分离的中性粒细胞中Mmp-9、Bv8、TRAIL、Nos2、Arg1基因表达,明胶酶谱法检测骨髓及腹腔分离中性粒细胞分泌MMP-9活性,Western blot检测骨髓及腹腔分离中性粒细胞的Bv8、TRAIL、Nos2、Arg1蛋白表达情况。(4)采用IL-35、G-CSF/IL-6细胞因子体外直接刺激分离培养的中性粒细胞,然后实时荧光定量PCR检测中性粒细胞中Mmp-9、Bv8、TRAIL、Nos2、Arg1基因的表达。在另一组试验中,体内分别转染pG-CSF、pIL-6、pG-CSF/pIL-6质粒,分离骨髓中性粒细胞,实时荧光定量PCR及Western blot检测中性粒细胞诱导性一氧化氮合酶的表达。(5)采用实时荧光定量PCR及Western blot分别检测体内外G-CSF、IL-6作用后中性粒细胞中iNOS上调的信号途径机制。

(6)实时荧光定量PCR检测pIL-35质粒转染后小鼠脾脏、肺、骨髓组织中G-CSF、IL-6和TGF-β1的表达变化,ELISA法检测pIL-35质粒转染后小鼠不同时间点血清中G-CSF、IL-6细胞因子浓度。(7)采用M-CSF体外诱导培养骨髓源性巨噬细胞,并采用不同浓度IL-35细胞因子体外刺激,实时荧光定量PCR检测巨噬细胞Gcsf、Il6和Il1b基因表达变化,ELISA法检测培养上清液中G-CSF、IL-6和IL-1β细胞因子浓度。(8)流式细胞分析pIL-35质粒转染后小鼠脾脏

CD4+IL-17A+细胞数量;ELISA法检测pIL-35质粒转染后小鼠外周血IL-17A和IL-1β细胞因子浓度,以及抗IL-17A处理后外周血G-CSF 细胞因子浓度和抗γδ T细胞、抗IL-1β分别处理后外周血中G-CSF

和IL-17A细胞因子浓度。结果:(1)IL-35促进肿瘤微环境中性粒细

胞浸润,促进骨髓中性粒细胞动员,在肿瘤微环境,中性粒细胞趋化因

子CCL2和VEGF显著增加。(2)pIL-35质粒转染的小鼠,由CXCL1募

集的中性粒细胞显著促进肿瘤生长;在混合接种试验中,分离自

pIL-35质粒转染小鼠骨髓及腹腔来源的中性粒细胞也显著促进肿瘤

生长。(3)IL-35促进肿瘤组织微血管密度增加;在IL-35过表达的小鼠,无论骨髓或腹腔来源的中性粒细胞中MMP-9、Bv8、Nos2表达均显著增强,而TRAIL表达降低;此外,在脾细胞增殖试验中,IL-35过表达小鼠来源的骨髓中性粒细胞显著抑制脾脏T淋巴细胞增殖。(4)IL-35体外直接刺激并不导致骨髓中性粒细胞Mmp-9、Bv8、Nos2和TRAIL

表达改变,然而G-CSF、IL-6刺激能明显上调Mmp-9、Bv8、Nos2表达,下调TRAIL表达,且G-CSF、IL-6对Nos2上调有明显的协同作用;与

此一致的是,体内转染pG、pI6、pG/pI6质粒显著诱导骨髓中性粒细

胞表达iNOS。(5)机制上的研究表明G-CSF主要通过激活STAT3和ERK 途径介导中性粒细胞Nos2上调,而IL-6主要通过STAT3途径介导

Nos2上调;体内实验也显示转染pG/p16质粒的小鼠骨髓中性粒细胞STAT3和ERK磷酸化较对照组显著增强。(6)IL-35促进脾脏、肺、骨髓G-CSF和IL-6表达增加,但不影响TGF-β1表达,ELISA结果显示

IL-35显著增加外周血液G-CSF和IL-6细胞因子浓度。(7)IL-35体

外剂量依赖性促进巨噬细胞分泌IL-6和IL-1β,然而并不产生G-CSF。

(8)IL-35并不影响小鼠脾脏中CD4+IL-17A+细胞数量,然而却显著增

加外周血IL-17A、G-CSF和IL-1β浓度;在pIL-35质粒转染小鼠,中

和IL-17A显著降低血液中G-CSF水平,而中和IL-1β或耗竭γδ T 细胞则显著降低血液中IL-17A和G-CSF水平。结论:IL-35能够诱导中性粒细胞N2极化来促进肿瘤生长。其主要机制是直接促进巨噬细胞分泌IL-6和IL-1β,通过巨噬细胞/IL-1β/γδT细胞/IL-17轴间接促进体内G-CSF水平增加,升高的G-CSF和IL-6协同促进中性粒细胞促瘤功能转变。