分子生物学实验常用工具酶总结培训讲学

现代分子生物学实验手册

工具酶

基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。

工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。

一、限制性内切酶（restriction endonuclease）

主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）

限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。保护自身遗传物质稳定的机制。

限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。

命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：

细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I

Escherichia coli RY13Eco R I

Bacillus amyloliquefaciens H Ham H I Haemophilus influenzae Rd Hin d III

（一）三种常用内切酶

1. I型限制性内切酶

同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。

在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。（实际上，有内切酶、修饰酶、ATP酶及解旋酶四种功能）I型限制性内切酶在DNA链上的识别位点和切割位点不一致，也不固定。没有时间应用价值。

【DNA甲基化：DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现（外遗传机制）。多发生于CpG二核苷序列上（在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸中的胞嘧啶被选择性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶）。甲基化位点可随DNA的复制而遗传（DNA复制后，甲基化酶可将新和成的未甲基化的位点进行甲基化）。DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶

的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。】

2. III型限制性内切酶

具有内切酶和甲基化修饰酶作用。

具有专一的识别顺序，其切割位点在识别顺序旁边的几个核苷酸对的固定位置上。（可识别短的不对称序列，切割位点与识别序列约距24~26bp）

3.II型限制性内切酶

也具有限制-修饰系统，但由限制酶和修饰酶这两种不同的酶共同来执行这一系统的功能。即II型限制性内切酶有在识别位点的切割功能，而不具备甲基化修饰活性，修饰作用由相应的修饰酶完成。两种酶识别同一DNA特定序列，却发挥不同作用。

能识别双链DNA的特异顺序，并在该顺序内的固定位置上进行切割，产生特异的DNA片段。

II型限制性内切酶的识别位点和切割位点是专一和固定的，对相同的基因片段的切割，总是得到同样核苷酸顺序的小DNA片段。这些切割后的不同大小的DNA片段，可以与统一内切酶切割后的来源不同的其他DNA片段实行连接，而构建重组DNA。——基因工程技术的核心

II型限制性内切酶识别的专一核苷酸顺序，最常见的是4~6个碱基对。

II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序（反转重复顺序），具有180°的旋转对称性。识别顺序有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方面读序都是相同的。这类酶切割DNA可有两种形式。

①交错切割方式：

每种酶切割后个产生两个DNA片段，每一个片段个含有一个单链末端，单链末端是互补的，可以通过形成“氢键”而黏合。

不同来源的两条DNA片段经同一种酶切割后，产生互补的黏性末端，通过选择合适的DNA链接，可将两条异源性DNA片段组合在一起。——重组DNA 的最基本原理

用选择专一性不同而产生相同黏性末端的两种酶切割两条不同的DNA片段，可使重组后的DNA片段不再被原来的酶所切割。

如：Sal I酶切割后产生的黏性末端，Xho I酶切割后产生的黏性末端

，两者经连接酶连接产生的序列，既不被Sal I酶切割，也不被Xho I酶切割。<在质粒改造上很有用>

②在同一位置上切割DNA双链，产生平头末端。

如：

（二）其他类型内切酶

1.同工酶（Boschizomer）：来源不同的两种II型内切酶，它们识别核苷酸顺序及切割位点都相同，差别只在于当识别核苷酸序列中有甲基化的核苷酸时，一种内切酶可以切割，而另一种不能。

如：Hpa II和Msp I识别顺序都是5’···CCGG···3’，若其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Msp酶可切割（GGmCC）。

2.Subset酶：识别顺序及切割位点相互有关的酶，互称Subset酶。

如：Sam I酶所识别的6个核苷酸顺序中含有Hpa II酶识别的4个核苷酸顺序。所以这两个酶可以相互代替使用，它们所切割的DNA片段可以相互连接。

3.可变酶（特殊的）：识别核苷酸顺序一般都大于6个，但其中一个或几个核苷酸时可以变化的。

4.远距离切割酶：识别核苷酸顺序的位置与切割的位点不一致，一般切割位点与指标核苷酸顺序的位置之间有10个左右核苷酸的距离。与I型内切酶相似，不过I型内切酶识别位点与切割位点的距离更远一些。

（三）甲基化酶（不属于内切酶）

使识别顺序中的某个核苷酸发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。

M5C（5-甲基胞嘧啶）大多数以M5CpG的形式存在，即CpG岛中的C最容易是甲基化的底物，而甲基化又与受之调控的基因的表达程度有关。因此，研究CpG岛的甲基化是研究基因调控的一个重要方向。

当甲基化酶和限制性内切酶共同使用时，常常可以使有多个识别位点的内切酶只对其中一个识别位点有切割效果，其他位点因被甲基化酶修饰而不能被切割。

如：限制性内切酶AvaⅠ的识别顺序是

Py可以是任何一种嘧啶，pu可以是任何一种嘌呤。因此可以有4种识别顺序。如果同时使用甲基化酶TaqⅠ和甲基化酶HpaⅡ，则AvaⅠ的识别顺序将只是5’……CCCGAG……3’。