第五章分子发光分析法讲义
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第5章分子发光分析法PPT课件
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。
内转换：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第
一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频
率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激
发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
样）成镜像对称关系。
22.11.2020
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
22.11.2020
三、荧光的产生与分子结构的关系
（实际上只有很少的有机分子能发射荧光）
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。
系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通
过自旋—轨道耦合等作用完成系间跨越。
22.11.2020
（2）辐射能量传递过程（辐射跃迁）
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
内转换：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第
一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频
率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激
发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
样）成镜像对称关系。
22.11.2020
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
22.11.2020
三、荧光的产生与分子结构的关系
（实际上只有很少的有机分子能发射荧光）
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。
系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通
过自旋—轨道耦合等作用完成系间跨越。
22.11.2020
（2）辐射能量传递过程（辐射跃迁）
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
第五章 分子发光分析法PPT课件
菏泽学院化学与化工系
9
(二) 荧光效率及其影响因素 1. 荧光效率 发射荧光的分子数目与激发态分子总数的比值。
荧光效率（f）=
发荧光的分子数 激发态分子总数
也可以各种跃迁的速率常数表示
f
Kf K f Ki
式中：Kf为荧光发射过程的速率常数，∑Ki为非辐射跃迁的 速率常数之和。一般来说，Kf决定于物质的化学结构；∑Ki 主要决定于化学环境，同时也与化学结构相关，有分析应用
长；
‘ 2
>
2
>
1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
2020/10/31
的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”
。
系间跨越(intersystem conversion)：不同多重态,有重叠的转动
能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋
—轨道耦合进行。
2020/10/31
❖ 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种 现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是 由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。
2020/10/31
分子发光光谱法
振动驰豫
S2
S1 系
间
内转换
跨 跃
T1
外转换
S0 λ1 吸光
λ2 λ3 吸光 荧光
S0 λ4 磷光
荧光发射：当分子处在单重态的最低振动能层时， 去激发过程是以10-7～10-9s左右的时间内发射一个 光子回到基态。
磷光发射：激发态分子经过系间跨跃到激发三重态 后，并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态 （T1）的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子 返回基态。 磷光的寿命比荧光的要长得多
• 从图中看出 • 磷＞ 荧＞ 激 * 易产生荧光 n * 易产生磷光
二、激发光谱和发射光谱
固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波 长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系作图， 得到激发光谱曲线。
选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不 同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或 磷光光谱曲线。
碰撞熄灭将随温度的升高而增加；将随溶液黏度的减小而增大。
（ⅱ）能量转移 它是指处于激发单重态的荧光分子M*与熄灭 剂相互作用后，发生能量转移，使熄灭剂得到激发，其反应如下
(ⅲ) 组成化合物的熄灭 它是指熄灭剂和荧光分子在基态时发生 配合反应，生成不发荧光的配合物。
(ⅳ) 自熄灭和自吸收 当荧光物质浓度较大时，常会发生自 熄灭现象，这可能由于激发态分子之间的碰撞引起能量损 失。假如荧光物质的吸收光谱和发射光谱有较大的重叠， 由荧光物质发射的荧光，有一部分可能会被它自身的基态 分子所吸收，这种现象称为自吸收。随荧光物质浓度的增 加，自吸收现象将会加剧。
荧光—荧光分析法
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析
法
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法
2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
第五章分子发光分析法讲义
⑵、内转换（ic）
指相同多重态的两个电子态之间（S2 S1，S1 S0） 的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转 移至低能级。如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层 相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动 驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
例: 区别谱图中的 三个峰，说明判断
原则。
（三）、荧光效率及其影响因素：
1、分子产生荧光必须具备的条件：
⑴、分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的 结构，才能吸收激发光；
⑵、吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率（荧光效率）
2、荧光效率 ⑴、荧光效率
发荧光的分子数
f 激发态分子总数
在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生，因而使荧光减弱。
4）、荧光发射（Fluorescence） 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活
化过程的一种形式是以10-9~10-6s左右的短时间发射一 个光子返回基态。这一过程称为荧光发射。 （单重— 单重，停10-9——10-6s ）
2
S2 1
V=0
2
S1 1
V=0
VR
ic
F
S0
3 2
1
V=0
λ1 λ2 λ3
isc
2 1
T1
V=0
VR
P
ic
isc
F P
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
1、激发光谱：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择 合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定
以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变 激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为 横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
指相同多重态的两个电子态之间（S2 S1，S1 S0） 的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转 移至低能级。如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层 相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动 驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
例: 区别谱图中的 三个峰，说明判断
原则。
（三）、荧光效率及其影响因素：
1、分子产生荧光必须具备的条件：
⑴、分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的 结构，才能吸收激发光；
⑵、吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率（荧光效率）
2、荧光效率 ⑴、荧光效率
发荧光的分子数
f 激发态分子总数
在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生，因而使荧光减弱。
4）、荧光发射（Fluorescence） 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活
化过程的一种形式是以10-9~10-6s左右的短时间发射一 个光子返回基态。这一过程称为荧光发射。 （单重— 单重，停10-9——10-6s ）
2
S2 1
V=0
2
S1 1
V=0
VR
ic
F
S0
3 2
1
V=0
λ1 λ2 λ3
isc
2 1
T1
V=0
VR
P
ic
isc
F P
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
1、激发光谱：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择 合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定
以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变 激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为 横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
第五章 分子发光分析法
s
体系间窜跃（ 不同多重态, 体系间窜跃（ isc ）：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐 射跃迁（ S1→T1跃迁 跃迁） 磷光发射：电子由第一激发三重态 射跃迁（ S1→T1跃迁） 。磷光发射：电子由第一激发三重态 的最低振动能级( =0)跃迁至基态各振动能级 跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁 跃迁）。 的最低振动能级(v=0)跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁）。 S2 Intersystem Crossing 系间窜跃 S1 磷光发射 Phosphorescence T1
第五章 分子发光分析法
基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态， 基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时 分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时， 便产生分子发光 分子发光（ 便产生分子发光（Molecular Luminescence）。 ）。 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、 荧光和磷光两种）、热致发 （按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、热致发 场致发光和化学发光等 光、场致发光和化学发光等。 本 分子荧光（Molecular Fluorescence）、 分子荧光（ ）、 章 分子磷光（ 分子磷光（Molecular Phosphorescence） ） 化学发光（ 化学发光（Chemiluminescence） ）
S0 λ2 λ1
内转移（ ） 相同多重态的两个电子能级之间 之间（ 内转移（ic） ：相同多重态的两个电子能级之间（如S2 S1,S1 S0）的非辐射跃迁 。 ）
S2 T1 S1
S0 λ2 λ1
5 荧光分析
3. 刚性平面结构
荧光物质的刚性和平面 性增加，有利于荧光发射。
芴 联苯
F=1
F=0.2
-O
O C
O
N N
荧光黄 不产生荧光
产生荧光
偶氮苯
COO-
F=0.92
-O C COOO
N N
偶氮菲
酚酞 产生荧光 不产生荧光
H3C CH3
萘 VA
CH2OH
F(萘)= 5F(VA)
4. 取代基效应
一、分子荧光与磷光的产生
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1.单重态与三重态
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数 和(0或1)； 单重态：全部轨道里的电子都是自旋配对的，S=0,M=1； 三重态：分子具有自旋不配对的电子，S=1,M=3. 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重 态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；
1
K1 [M*]
M* Q k 2 M Q ΔH K2 [M*] [Q]
共振能量转移：
D* D hv , A hv A*
分子内能量转移：
N
D* ( S1 ) A( S 0 ) D( S 0 ) A* ( S1 ) D* (T1 ) A( S 0 ) D( S 0 ) A* ( S1 )
CH3 CH3
hv
+
_
N
CH3
CH3
（3） 氧的熄灭作用 氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，
1
3
M O 2 3 M* 3 O 2
分析化学(仪器分析)第五章 分子发光分析法
给电子基团(-OH, -NH2, -NR2, -OR)使共轭体系增 大，导致荧光增强。反之， 吸电子基团(-COOH, NO, -NO2)使荧光减弱。
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
23
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
23
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
《分子发光分析法》PPT课件
F
0.11 0.29
λexmax(nm) 205 286
λemmax (nm) 278 321
蒽
丁省
0.46
0.60
365
390
400
480
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7-2
戊省 0.52 580 640
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3.荧光与分子结构的关系
• 2）刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面性增加，
有利于荧光发射。
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3. 荧光和磷光光谱的产生
（1）荧光：
S1或T1 发光 S0
当电子从第一激发单重态S1的最低振动 能级回到基态S0各振动能级所产生的光 辐射叫荧光
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生 速度快，10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬 时荧光，外部光源停止照射，荧光马上 猝灭
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7-2 提要 返10 回
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7-2 分子荧光分析法及其原理
• 一、分子荧光和磷光的产生
1.电子自旋状态的多重性
2. 无辐射跃迁
3. 荧光和磷光光谱的产生
二、分子荧光分析法的基本原理
1.激发光谱和荧光谱
2.荧光强度及其与浓度的关系
3.荧光与分子结构的关系
4.影响荧光强度的因素
精选课件ppt
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一、荧光和磷光光谱的产生(图)
• 具有不饱和基团的基态分子光照后，价 电子跃迁产生荧光和磷光
基态分子
光照激发
价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基态
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7-2
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1. 电子自旋状态的多重性
• 单重态：用 “S0” 表示 • 当物质受光照射时，基态电子能级跃迁至
分子发光分析法概况课件
分子发光分析法的优缺点
优点
高灵敏度
分子发光分析法通常具 有很高的灵敏度，能够 检测出低浓度的目标物
。
选择性
某些发光分子可以与目 标物发生特异性反应， 从而提高分析的选择性
。
操作简便
分子发光分析法通常操 作简单，所需仪器设备 相对简单，便于现场快
速检测。
缺点
背景干扰
发光分析法容易受到环 境背景光的影响，如日 光、荧光等，导致检测
01
02
研发能够延长发光分子寿命 的技术，以减少检测过程中
的误差和不确定性。
03
04
克服背景干扰
研究和发展能够有效排除背 景光干扰的技术和方法，以 提高检测的稳定性和准确性
。
拓展应用领域
进一步探索发光分析法在环 境监测、生物医药、食品安 全等领域的应用，以满足更
广泛的需求。
06 结论
总结分子发光分析法的概况与重要性
结果不稳定。
发光衰减
某些发光分子的发光强 度会随时间衰减，影响 检测的准确性和稳定性
。
成本较高
某些高灵敏度的发光分 子和仪器设备成本较高 ，限制了其在某些领域
的应用。
未来发展方向与挑战
提高灵敏度和选择性
延长发光寿命
进一步研发具有更高灵敏度 和选择性的发光分子，以满 足更低检测限和更高准确性
的需求。
新型的分子发光分析方法和技术不断 涌现，如荧光免疫分析、荧光偏振免 疫分析、时间分辨荧光免疫分析等。
02
分子发光分析法的基本原理
分子发光的过程与机制
01
分子发光是指分子吸收能量后，由基态跃迁至激发态，再由激 发态回到基态时释放光子的过程。
02
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光致发光
Photoluminescent
荧光Fluorescence 磷光Phosphorescence
热致发光
场致发光
化学发光 Chemiluminescence
第五章分子发光分析法讲义
§5-1 荧光分析法
分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定 性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。 一、基本原理： （一）、分子荧光（磷光）的产生：
发射荧光的能量比分子所吸收的能量要小，即荧光 的特征波长比它所吸收的特征波长要长。
注意：基态中也有振动驰豫跃迁。λ3＞λ1或λ2 ，不 论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波 长为λ3的荧光。
第五章分子发光分析法讲义
（5）、磷光发射（Phosphorescence） 从单重态到三重态的分子体系间窜跃发生后，接着发生
室温下，大多数分子处在基态的最低振动能层。 处于基态的分子吸收能量（电能、热能、化学能或光 能）后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变 到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现 象称为“发光”。
第五章分子发光分析法讲义
单重态，激发单重态，三重态：
第五章分子发光分析法讲义
去活化过程：处于激发态的分子是不稳定的，它可 能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回基态。 由较高能态到较低能态的过程( E* E0 ) 其中，以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。
E磷 E荧 E激
磷 荧 激
第五章分子发光分析法讲义
2、激发光谱和荧光光谱的特点： （1）荧光光谱的形状与激发光波长无关
荧光物质吸收不同波长的激 发光可被激发到不同能态，通过 振动驰豫和内部转换最终都将达 到第一激发单重态的最低振动能 级，然后再发射荧光。故蒽的激 发光谱虽在250nm和350nm有两 个峰，不论用哪一个峰的波长作 激发光源，所得荧光光谱的形状 和峰的位置都是相同的。
以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变 激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为 横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
相
Ⅰ
对
强
度
Ⅱ
Ⅲ
萘的激发光谱Ⅰ 荧光光谱Ⅱ 磷光光谱Ⅲ
200 300
400
500
λ
第五章分子发光分析法讲义
荧光或磷光光谱曲线: 固定激发光波长为其最 大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或 磷光强度，将荧光的光波长为横座标，荧光强度为纵 座标作图便可得到荧光光谱（发射光谱）。
第五章分子发光分析法讲义
VR 2
S2 1
V=0
ic
2
S1 1
V=0
isc
2 1
T1
V=0
F
VR
P
ic
S0
3 2
isc
1
V=0
F
λ1 λ2 λ3
第五章分子发光分析法讲义
P
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
1、激发光谱：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择 合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定
快速的振动驰豫而到达三重态的最低能层上，此时可能由 两种途径返回基态： ①体系间窜跃 ②在10-4~10s左右时间内辐射跃迁回基态而发生磷光.这种 跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。 （三重—单重，停10-4-10s，液氮冷冻试样，才可见磷光） 荧光和磷光的根本区别:
荧光是由单重-单重跃迁引起的， 磷光则由三重-单重跃迁产生的。
第五章分子发光分析法讲义
去活化过程
发射光子
非辐射跃迁
化学反应
荧光 磷光
振动驰豫 内转换 外转换 体系间窜跃
VR
ic
isc
P——磷光（三重—单重，停10-4-10s） F——荧光（单重—单重，停10-9- 10-6s ）
第五章分子发光分析法讲义
去活化过程： ⑴、振动驰豫（VR） 在同一能级中，分子由较高振动能级向该电子态的 最低振动能级的非辐射跃迁。其速率极大，10-14~10-12s 内即可完成。 ⑵、内转换（ic） 指相同多重态的两个电子态之间（S2 S1，S1 S0） 的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转 移至低能级。如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层 相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动 驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
第五章分子发光分析法讲义
观察磷光现象时，试样要用液氮冷冻 a.三重态与基态之间的能量差要比最低激发态和 基态之间的能量差小，这使三重态与基态之间的振动 偶合增强，因而增强了内部转换； b.激发三重态的寿命比激发单重态的寿命长，因 而同溶剂分子碰撞而失去激发能的可能性增大，以致 在室温条件下不能观察到溶液的磷光。 因此，观察磷光现象时，试样要用液氮冷冻以使 碰撞去活化和振动偶合去活化降至最低限度
第五章分子发光分析法讲义
（2） 荧光光谱和激发光谱成镜像关系 从图可看出激发光谱同荧光光
谱大致成镜像对称 a. 荧光光谱(发射光谱）形状
与基态S0振动能级的分布情况 （即能量间隔情况）有关
含有重原子（碘、溴等）的分子中，体系间跨越 跃迁最为常见。
在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生，因而使荧光减弱。
第五章分子发光分析法讲义
4）、荧光发射（Fluorescence） 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活
化过程的一种形式是以10-9~10-6s左右的短时间发射一 个光子返回基态。这一过程称为荧光发射。 （单重— 单重，停10-9——10-6s ）
仪器分析 Instrumental Analysis
第五章 分子发光分析法
（Molecular luminescence analysis) §5-1 概述 §5-2 荧光分析法 §5-3 磷光分析法 §5-4 化学发光分析法
第五章分子发光分析法讲义
基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态。当 激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时， 便产生分子发光。
第五章分子发光分析法讲义
VR 2
S2 1
V=0
ic
2
S1 1
V=0
isc
2 1
T1
V=0
F
VR
P
ic
S0
3 2
isc
1
V=0
F
λ1 λ2 λ3
第五章分子发光分析法讲义
P
（3）、体系间窜跃（isc） 指不同多重态的两个电子之间的非辐射跃迁。
它涉及受激发电子自旋状态的改变，如S1 T1，使原 来两个自旋配对的电子不再配对，这种跃迁是禁阻跃 迁。