细胞培养与病毒培养实验步骤
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
病毒培养的原理和流程
病毒培养的原理和流程英文回答：Principle of Virus Culture.Virus culture is the process of growing viruses in a living host system, such as cell culture or animals. The purpose of virus culture is to isolate and propagate viruses for diagnostic, research, or vaccine development purposes.Viruses are obligate intracellular parasites, meaning they require a living host cell to replicate. In virus culture, viruses are introduced into a host system that is permissive to their growth. The permissive host system provides the necessary cellular machinery and nutrients for the virus to replicate.Process of Virus Culture.The process of virus culture typically involves the following steps:1. Specimen collection: A specimen containing the virus of interest is collected from the patient or the environment.2. Sample preparation: The specimen is processed to remove any contaminants or debris that could interfere with virus culture.3. Inoculation: The prepared sample is inoculated intoa permissive host system. This can be done by injecting the sample into the host, adding the sample to a cell culture, or exposing the host to the sample through the respiratory tract or other routes of infection.4. Incubation: The inoculated host system is incubated at a temperature and environment that is optimal for virus growth.5. Observation: The host system is monitored for signsof virus growth. This can include changes in cell morphology, the presence of viral inclusions, or the development of cytopathic effects (CPE).6. Harvesting: Once the virus has grown to a sufficient titer, it can be harvested from the host system. This can be done by collecting the infected cells or fluids from the host.7. Isolation: The harvested virus can be further isolated and purified using techniques such as plaque isolation or monoclonal antibody purification.中文回答：病毒培养的原理。
病毒培养方法
病毒培养方法
病毒培养是一种重要的实验技术，它在病毒学研究、疫苗生产和药物筛选等领域都有着广泛的应用。
正确的病毒培养方法可以保证病毒的纯度和活性，为后续的实验研究提供可靠的基础。
下面将介绍一种常用的病毒培养方法，供大家参考。
首先，准备培养基和细胞。
常用的培养基有DMEM、MEM等，细胞可以选择HEK293、Vero等。
将培养基加热至37摄氏度，使其保持体温。
其次，接种病毒。
将培养基加热后，将其放置在无菌工作台上。
然后，将需要接种的病毒加入培养基中，轻轻摇匀。
接着，将接种好病毒的培养基加入到细胞培养皿中。
将培养皿放置在37摄氏度的恒温培养箱中，培养一定时间。
在培养的过程中，需要定期观察细胞的情况。
通常情况下，细胞会出现明显的变化，比如颜色的改变、细胞的增殖等。
这些都是培养是否成功的重要指标。
最后，收获病毒。
当细胞出现明显的病毒感染迹象时，可以收获病毒。
首先，将细胞培养液离心，离心后的上清液中含有病毒。
然后，将上清液收集起来，经过一系列的离心、过滤等步骤，最终得到纯净的病毒溶液。
总的来说，病毒培养是一项复杂的实验技术，需要严格的操作流程和高超的实验技巧。
只有掌握了正确的病毒培养方法，才能够保证病毒的纯度和活性，为后续的实验研究提供可靠的基础。
希望以上介绍的病毒培养方法对大家有所帮助，谢谢阅读！。
病毒培养方法
病毒培养方法病毒培养是研究病毒特性和生物学行为的重要手段，也是疫苗和抗病毒药物研发的基础。
正确的病毒培养方法能够保证病毒在细胞内稳定生长，为后续实验提供可靠的数据支持。
下面将介绍一般的病毒培养方法。
首先，选择合适的宿主细胞。
不同种类的病毒需要不同的宿主细胞进行培养，常用的宿主细胞有Vero细胞、HEK293细胞、MDCK 细胞等。
在选择宿主细胞时，需要考虑病毒对细胞的亲和性和感染能力，确保病毒能够有效地感染和复制。
其次，培养宿主细胞。
宿主细胞的培养条件对病毒的生长和复制起着至关重要的作用。
通常情况下，宿主细胞需要在无菌条件下培养，培养基的选择和配方也需要根据不同的宿主细胞进行调整。
在培养过程中，需要定期更换培养基，控制培养密度，以确保细胞的健康状态。
接着，感染宿主细胞。
将病毒悬液加入到培养基中，使病毒与宿主细胞发生感染。
感染后的细胞需要在适当的温度和湿度条件下进行培养，促进病毒的复制和扩散。
在感染后的一段时间内，可以观察细胞的形态变化和病毒效应，以判断感染情况。
最后，收获病毒。
当感染细胞出现明显的病毒效应并且病毒滴度达到一定水平时，可以收获病毒。
收获病毒时需要注意保持病毒的活性和纯度，通常采用离心、滤过等方法进行病毒精制。
收获的病毒可以用于后续的实验研究，也可以用于疫苗和药物的研发。
总之，病毒培养是病毒学研究中不可或缺的一环，正确的病毒培养方法能够保证病毒的活性和稳定性，为后续的实验提供可靠的数据支持。
在进行病毒培养时，需要严格控制培养条件，确保实验的可重复性和准确性。
希望本文介绍的病毒培养方法能够对研究人员有所帮助，促进病毒学研究的发展。
实验十病毒的细胞培养
实验十病毒的细胞培养
一、目的：掌握传代细胞的传代和培养方法，认识BVDV在MCBK细胞上产生的CPE
特征。
二、实验步骤
1、细胞分散液的配制：取10倍浓缩的EDTA、胰蛋白酶细胞分散液1mL，加入9mL双
重去离子灭菌蒸馏水混合即成。
2、细胞生长液：含8%FCS、1%谷氨酰胺、2%双抗的MEM以7.5%碳酸氢钠矫正pH值
为7.2（粉红色，MEM内含有中性红指示剂）。
3、细胞传代与培养：取长满单层的MCBK细胞，弃去细胞培养液，加入细胞培养瓶体
积0.5%的细胞分散液，冲洗整个瓶体，再以细胞分散液摇动消化细胞2次，最后加入少许分散液，于37℃温箱内消化，待细胞变成云雾状（细胞间质已分开），轻轻振克数次，使细胞从瓶壁脱落后，迅速加入细胞生长液，大口吸管吹打数次，分装到2各细胞培养瓶内，37℃温箱静止培养。
4、病毒接种与收获：单层接种（吸附与不吸附）法接毒后，加入细胞维持液。
同步接种
法接毒后，加入细胞生长液，次日换成细胞维持液。
每日观察CPE，当CPE达到75%时置于冰箱内冻结收获。
5、病毒的鉴定：进行形态学（电镜负染、超薄切片观察）、理化学（耐酸、耐乙醚和氯
仿、耐热试验等）、生物学（动物感染、血凝、细胞感染谱试验等）、免疫学（中和试验、荧光抗体试验等）和分子生物学（病毒蛋白分析、PCR、核酸探针试验等）等鉴定。
三、实验报告内容
1、单层细胞传代和培养的注意事项。
2、试述细胞培养的优点。
3、细胞接毒方法的种类及优缺点。
4、病毒鉴定的方法常用的有那些。
病毒学研究中的实验技术
病毒学研究中的实验技术病毒学是研究病毒性疾病的科学。
病毒性疾病的病原体是病毒，而病毒无法自行进行代谢活动，必须寄生在宿主细胞内完成其生命活动，因此病毒性疾病是难以治愈的。
病毒学家通过从分子层面研究病毒的结构、生命周期和致病机制等方面，探究病毒感染机制和防治策略。
但是病毒性疾病的研究需要大量的实验技术支持，下面介绍一些病毒学研究中常用的实验技术。
一、细胞培养技术病毒感染的第一步是入侵宿主细胞，因此病毒学研究中不可避免地涉及到细胞培养技术。
细胞培养技术是把生物组织或细胞通过培养基、营养物质等条件模拟人体内环境来培育或生长。
常用的细胞培养技术包括原代细胞培养、细胞系培养和三维细胞培养。
原代细胞培养是将组织切碎后通过酶的作用将细胞分离培养，有原始细胞的特点；细胞系培养是通过连续传代保留的一种相同的细胞群体，细胞系一般在细胞数目增高到一定阶段会停滞不生长，从而要定期传代；三维细胞培养则是将细胞以3D结构的形式培养，可以模拟更接近真实环境的细胞生长。
二、病毒制备技术病毒制备技术是研究病毒性疾病的基础。
制备好的病毒才能在实验中进行感染、药物筛选等研究。
病毒制备技术不同于普通的细胞培养技术，主要包括以下步骤：选择适宜的病毒感染细胞、制备病毒原液、病毒上清的浓缩、纯化和滤过等。
在实际制备中，还需要时刻注意环境卫生和安全控制等因素，保证实验和研究的可行性和可靠性。
三、病毒感染实验技术病毒感染实验技术是研究病毒性疾病的核心。
病毒感染实验技术主要包括病毒感染模型建立、病毒感染实验的设计、病毒感染后的分析与诊断等。
在病毒感染实验中，常常使用到Green Fluorescent Protein (GFP)、Luciferase、β-galactosidase等荧光物质和化学指标来评估病毒感染情况和细胞的生长状态。
此外，病毒感染实验中还会运用到PCR、Western blot等分子和蛋白质分析技术来探究感染机制和影响。
四、病毒抗原与抗体的检测技术病毒的抗原与抗体检测是病毒学研究的重要环节。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
细胞培养操作流程
细胞培养操作流程细胞培养是一种人工环境中扩增和维持活细胞的技术。
它对于研究细胞生物学、药物筛选和治疗等方面有着重要的应用。
下面是一个常见的细胞培养操作流程，具体步骤如下：1.准备培养器具和试剂：首先需要准备好培养器具和所需试剂，包括培养皿、离心管、培养基、培养液、胶原蛋白贴士等。
2.细胞的分离和收获：将待培养的组织或细胞样品取出，用适当的方法将细胞分离开来。
可以使用酶消化、机械切割或筛选等方法。
分离好的细胞通过离心将细胞沉淀，将上清液吸掉，得到细胞沉淀。
3.细胞计数和浓度调整：使用细胞计数仪或血球计数室等工具，将细胞计数。
根据需要可以进行浓度调整，使其适合在培养器具中的扩增。
4.细胞的接种和培养：将得到的细胞沉淀重新悬浮于培养基中，并将其放置于培养皿中。
确定适宜的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
定期观察细胞的生长情况，并更换培养基，以维持细胞的健康生长。
5.细胞的传代：当细胞在培养皿中达到一定密度时，需要进行传代，以防止细胞群体过于致密导致细胞生长受限。
传代前需先将细胞沉淀，并用如十倍的细胞培养基将其重新悬浮。
将悬浮的细胞分装至新的培养皿中，培养基的更换和细胞的观察也是相同的。
6.试验处理：在细胞培养过程中，可能需要对细胞进行各种试验处理，如药物处理、感染等。
根据需要，将试验处理物加入培养基中，确保细胞接触到试剂，并保持正常生长。
7.细胞固定和染色：进行一些试验或者观察时，对细胞进行固定和染色可以帮助观察或者分析细胞的形态、细胞器分布等。
选择适合的固定和染色方法，将细胞固定在培养皿中，并使用染色剂染色。
8.细胞的收集和保存：在实验完毕后，可以用适当的方法将培养皿中的细胞收集起来。
例如，轻轻洗涤细胞，然后加入适当的缓冲液，用吸管吸出，或者使用离心机离心沉淀。
收集好的细胞可以用于下一步的实验，或者进行冷冻保存。
9.培养器具的清洁和消毒：一旦细胞收集完毕，需要对使用过的培养器具进行清洗和消毒，以防止细菌、真菌、病毒等的传播。
病毒分离培养的细胞培养法
第18章病毒分离培养的细胞培养法一、细胞培养用于病毒研究的优点：细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛，除用作病毒的病原分离外，还可研究病毒的繁殖过程及其细胞的敏感性和传染性（细胞的病理变化及包涵体的形成）。
观察病毒传染时细胞新陈代谢的改变，探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制，以及研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性，可用于病毒的分离鉴定，抗原的制备及疫苗，干扰素的生产、病毒性疾病诊断和流行病学调查等。
近年来，可用于繁殖病毒载体以用于基因治疗。
应用细胞培养来研究病毒有下列优点：1、没有隐性感染：动物可能带有某些病毒的隐性感染，往往有干扰作用和假阳性出现。
细胞培养一方面是来源于动物部分组织，减少了隐性感染的机会，另一方面组织培养细胞可进行预先检查而加以克服。
2、没有免疫力：动物经隐性感染获得免疫力，对接种病毒会发生抵抗，但由于后天免疫一般不表现在细胞抵抗力的增加，因此离体细胞无免疫力，利于病毒生长。
3、容易选择易感细胞：细胞来源方便，可供作病毒敏感性的筛选，可以从中选择最敏感的细胞以满足实验要求，同时还利于从单一细胞水平上研究病毒的繁殖过程和病毒一细胞的相互关系。
4、接种量大：动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制，细胞不仅可以大量生产，而且还可较久地持续培养，便于病毒生长，特别是对那些生长缓慢或需在新环境中逐渐适应的病毒更为有利。
5、培养条件易于控制：由于细胞培养可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分，因此可采用大规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。
6、提高了疫苗的产量和质量：细胞的大量生产可满足疫苗产量的需求，而且异性蛋白少，引起变态反应机会少。
疫苗中污染菌少或无，可随制随用，成本低，来源方便，便于贮存，且效力均匀，易标准化。
7、加速病毒分离过程：病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速早出结果，但应用对该病毒敏感的细胞。
二、用细胞培养分离病毒(一)接种标本的处理：1、粪便标本：用于分离肠道病毒之粪便标本放入装玻璃珠40ml沉淀管内，大约每2克粪便用15ml Hanks液稀释(其余粪便于-20℃保存备用)，用橡皮塞紧后剧烈振摇，使粪便乳化，经2500r/min沉淀15分钟后，按将上清用无菌八层纱布过滤，于4℃以10000r/min沉淀1小时再取其上清，1.8ml加入0.2ml抗菌素液进行处理(浓度为25000u/ml的双抗及250mg/L二性霉素B)剩下的悬液保存于-20℃备用。
细胞培养中和试验TCID50原理方法
细胞培养中和试验TCID50原理方法细胞培养是一种在体外条件下培养和增殖细胞的技术。
细胞培养也被广泛应用于药物筛选、病毒检测和细胞生物学研究中。
其中，中和试验和TCID50是两种常用的方法，用于检测和评估病毒感染。
中和试验是通过将病毒与抗体进行反应，以评估抗体对病毒感染的阻断作用。
该方法主要包括以下步骤：1.准备病毒和抗体：选择所需的病毒株，并通过细胞培养等方法进行增殖。
准备足够的病毒悬液。
同样，选择合适的抗体，并制备一定浓度的抗体溶液。
2.混合病毒和抗体：将一定量的病毒溶液与一定浓度的抗体溶液混合。
混合后，使其在适当的温度和时间下进行反应。
3. 检测病毒感染：将混合物加入到适合病毒感染的细胞培养板中。
细胞培养板可使用动物细胞，如Vero细胞。
细胞在感染后，将会出现病毒感染的特征，如细胞破裂或形成病毒斑点。
4.评估感染程度：观察细胞培养板中的感染程度，并与对照组进行比较。
能够有效阻断病毒感染的抗体，将会降低病毒感染的程度。
TCID50（50%组织细胞感染量）是一种用于估算病毒颗粒浓度的方法。
该方法主要包括以下步骤：1.制备10倍稀释液：首先，取一定量的病毒悬液，并添加到稀释液中以制备10倍稀释液。
逐步将病毒悬液依次稀释。
2.感染细胞：将稀释后的病毒悬液添加到含有细胞的孔板中。
通常，每个浓度的病毒溶液都会制备多个重复，并有一个对照组。
3.检测细胞感染：观察细胞在病毒感染后的变化。
可以通过显微镜观察，或使用染色方法来检测感染程度。
4.计算TCID50：根据对照组和感染组的细胞变化情况，使用统计学方法计算出TCID50值。
TCID50值代表在一定稀释度下，使50%的细胞感染的病毒颗粒浓度。
通过中和试验和TCID50方法，可以定量评估病毒和抗体之间的相互作用，并研究感染和抗感染机制。
此外，这些方法还可以用于病毒治疗和疫苗研发中的效力评估。
病毒的细胞培养
细胞培养的基本概念
传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接 种到新的培养器皿中。
原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长 的细胞在传代之前称为原代培养。
二 主要优点
㈠ 研究的对象是活的细胞。 ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 ㈤ 研究的范围比较广泛。 ㈥ 研究的费用相对较经济。
5 12h后观察细胞病变，若无明显病变，则每隔3h 观察一次。当有70%细胞发生病变后，将细胞液反 复冻融3次，用吸管反复吹打数次，使病毒完全从 细胞中释放出来
正常形态的鸡 胚成纤维细胞
接毒后发生病变的 鸡胚成纤维细胞
（4）效价测定
某些病毒具有凝集某种哺乳动物红细胞的特性，利 用该特性而进行的试验称为病毒的血凝试验。
细胞冻存方法
（1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法 将细胞制成悬液并计数，800-1000r/min离心5min ，弃上清。
（2）用细胞冻存液将沉淀重悬，调整细胞浓度至 106-107个/ml，分装于冻存管，注明细胞名称，传 代及冻存日期。
（3）冷冻保存：将冻存管于4℃放置30min，然后 移入-80℃超低温冰箱过夜，再放入液氮罐长期保 存。亦可使用程序降温剂逐渐降温，冻存速度先 为每分钟下降速度1-2℃，当温度达到-25℃时，可 调整下降速度为每分钟5-10℃，温度降至-100℃时 ，再放入液氮罐中长期保存。
（4）细胞生长状况的观察
原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了解细胞形态
、数量及培养液pH值、污染与否等情况，以便采取相 应的措施处理。
肉眼观察 显微镜观察
（5）细胞的冻存
传代细胞应有充足的冻存储备。 一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的绝种。
《病毒的细胞培养》课件
细胞培养所需要的培养基、培养器具等设备和试剂成本较高，对实验室的经济投入和资 源管理提出了挑战。
常见的细胞培养方法
常见的细胞培养方法包括悬浮 培养、贴壁培养和3D培养等， 每种方法都有其特定的应用场 景和操作要点。
是人体组织、动物器官或者其他细胞培养实验中特定的细胞系。
2
细胞培养的条件
细胞培养需要提供适宜的培养基、温度、湿度、气体环境等条件来满足细胞的生长需 求。
研究领域中的应用
细胞培养为科学研究提供了重要手段，帮助科学家探索细胞的生长、分化、信号传导等关键 生物过程。
细胞培养的挑战
1 细胞的易受污染
细胞培养实验容易受到各种污染，因此需要严格的操作规范和无菌技术来保证实验的准 确性。
2 细胞的稳定性
细胞在长期培养中可能会发生突变、漂变等现象，导致实验结果的不稳定性，需要进行 细胞株的验证和维护。
3
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤包括细胞的种植、分离、传代、培养液的更换和细胞的检测等。
细胞培养的应用
生物医学领域中的应用
细胞培养在生物医学领域中广泛应用于药物筛选、疾病模型的构建和组织工程等重要研究方 向。
农业领域中的应用
细胞培养技术在农业领域中可以用于作物改良、病毒检测、种子培育等方面，提高农作物的 品质和产量。
《病毒的细胞培养》PPT 课件
在这份PPT课件中，我们将深入介绍病毒的细胞培养。通过精心设计的布局和 丰富的内容，帮助大家更好地理解细胞培养的背景、步骤、应用和挑战。
细胞培养概述
什么是细胞培养
细胞培养的意义
细胞培养是指将细胞从体内环 境转移到体外培养基内，为研 究和应用提供可控的实验条件。
细胞培养与病毒培养实验步骤
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
实验室细胞培养的一般步骤
实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。
下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。
第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。
培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。
根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。
第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。
通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。
分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。
第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。
接种密度要适当，不宜过稀或过密。
同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。
第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。
在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。
此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。
第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。
包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。
通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。
第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。
冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。
细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。
只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。
希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。
(整理)传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养.
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
疫苗细胞接毒原理
疫苗细胞接毒原理，通常指的是疫苗生产过程中的一种技术，称为细胞培养技术。
这种技术利用细胞作为生物反应器，在实验室条件下培养病毒，以生产疫苗。
以下是细胞培养疫苗的基本步骤和原理：
1.细胞选择：
选择合适的细胞系，这些细胞能够支持多种病毒的生长。
2.病毒接种：
将疫苗病毒株接种到这些细胞中。
病毒会在细胞内复制，利用细胞的机制来制造更多的病毒颗粒。
3.病毒复制：
病毒在细胞内复制，产生大量的病毒颗粒。
这些病毒颗粒随后会从细胞中释放出来。
4.病毒收获：
收集这些释放出来的病毒颗粒，这个过程可能包括过滤和纯化步骤，以去除细胞碎片和其他杂质。
5.灭活或减毒：
为了制成疫苗，病毒通常会被灭活（如使用甲醛）或减毒（通过连续传代使病毒毒力减弱），以消除其致病性，同时保留免疫原性。
6.制剂和包装：
将处理过的病毒颗粒与佐剂等成分混合，制成疫苗制剂。
将疫苗制剂填充到注射器或小瓶中，并进行包装。
7.质量控制：
在整个过程中进行严格的质量控制，确保疫苗的安全性和有效性。
细胞培养技术使得疫苗的生产能够在受控的实验室环境中进行，减少了对活病毒的依赖，提高了疫苗生产的安全性和效率。
此外，细胞培养还可以用于生产重组疫苗，这种疫苗是通过基因工程技术生产的，不含有活病毒，进一步降低了疫苗的风险。
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实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。
E、给培养液提供良好的缓冲系统。
F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。
4）应用血清存在的问题A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。
B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。
C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。
七、传代细胞系培养1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
3、培养方法1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。
3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。
再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。
八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。
2、加入适量的病毒悬液3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。
5、收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。
然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。
低温贮藏备用。
实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）一、实验目的了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。
二、材料1、9-11日龄鸡胚2、照蛋灯与蛋座3、碘酊棉球与酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小镊子5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、6、胰酶、生长液、维持液三、细胞培养的条件要求1）细胞密度原代细胞：4-6×105个/ml传代细胞：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃四、操作步骤1、取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。
4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。
如此反复冲洗2-3遍。
6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。
7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。
9、细胞计数取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
活细胞数应在90%以上。
10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于细胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
五、结果的观察○表示可计数●表示不计于培养后每天观察结果，至长层单层。
细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。
实验四病毒感染力的滴定（TCID50的测定）一、实验目的的操作步骤、计算方了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50法及含义。
二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测半数细胞培养物感染量TCID50蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。
3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCID50的计算方法 CPE：细胞病变效应1、Reed-Muench两氏法CPE：Cytopathic effect距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝ 0.8=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数lgTCID50=0.8×(-1)+(-3)=-3.8=10-3.8/0.1mlTCID50含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。
2、Karber法lgTCID=L-d(s-0.5)50L：最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID=-1-1×(3.375-0.5)50=-3.875=10-3.875/0.1mlTCID50含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。
实验五血清中和试验一、实验目的了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒—稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。
二、原理抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。
三、用途1、疾病诊断2、病毒分离株的鉴定3、不同病毒株的抗原关系研究4、疫苗免疫原性的评价5、免疫血清的质量评价6、测定实验动物血清中是否存在抗体四、分类(一) 蚀斑（痘斑）减数试验将病毒—正常血清混合物以及病毒—待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒—正常血清组和病毒—待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。
以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(二) 交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。
这一方法的缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。
可用于以下几方面：应用已知V鉴定未知V ；应用已知免疫血清鉴定未知V；应用已知V鉴定未知血清。
（三）终点法中和试验1、固定病毒—稀释血清法将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID50、EID50或LD50）混合，置适当的条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。
以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD50）。
2、固定血清——稀释病毒法在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。
五、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）6、待检血清、PRV 阳性对照血清、PRV 阴性对照血清 六、操作步骤1、固定病毒—稀释血清法 1）测定病毒液的TCID 502）将测好TCID 50的病毒液稀释成200个TCID 50的病毒悬液。
3）在96孔微量培养板中将血清（预先56℃灭活30min ）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50µl 生长液，再加50µl 待检血清，混匀后，吸50µl 至下一孔，如此下去。