如何选择合适的前处理方法

活化/平衡: MeOH/Water
上样
清洗1: 2% 甲酸水溶液 (目标锁定)
Acids (HA) 清洗2: 100% MeOH (强烈清洗)
A-
洗脱: 5% NH4OH-MeOH (目标释放)
14
0
2
4
6 8 pH
10
12
溶剂蒸发/重新定容 (选项)
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6
什么是 Oasis® HLB？ ‘HLB’= Hydrophilic Lipophilic Balance
N
O
亲水性 单体
亲脂性 单体
l
“亲水性结构”
l
l
“亲脂性结构”
提供反相保留特性
提供优良的浸润性 即使吸附剂干涸也无需担心回收率降低或分 析结果重现性不佳的问题
厂家 A C Waters
商品名 Bond Elut Plexa Poly-sery HLB Oasis HLB
磺胺胍 6.3 83.5 93.7
磺胺甲嘧啶 83.8 93.2 93.1
磺胺喹恶啉 95.9 96.4 96.6
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兽药残留检测项目/SPE
方法学验证
常规测试
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2
样品制备- 方法需求
多残留/ 多类别 整套方法(样品预处理& 分析 方法) 样品预处理流程 通用的一组不同的化合物 简单（ 一或两步) 速度 回收率& 净化需要在兼顾大量 目标物时要折中 低/中等 Tandem MS, Time-ofFlight 单一 或 同类化合物 单一或同类化合物 多步骤 最大的回收率& 基质净化率 最小的干扰/离子抑制 高等 Single quad MS, UV, FLR, ELS, GC* (FID or MS)
如何快速、高效的制备样品？ ————全面的样品前处理技术
Waters CBU marketing 王欣玲 2015.5 山东
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1
食品方法建立的一般流程
选择检测器，并建立方法 （GC,LC,GC/MS,LC/MS/MS）
色谱分离条件的建立
样品前处理方法的建立
Oasis MAX 6cc 500 mg SPE小柱
阳离子态和中性态化合物仅以反相机制保留， 因此可被纯有机溶剂清洗掉。
2
H3 C
N
N N
Enrofloxacin
COOH
Oasis MCX 1cc 30 mg SPE 小柱
F O
1
阳离子态化合物在Oasis MCX载体 上以离子交换方式被强力锁定。 阴离子态和中性态化合物仅以反相 机制保留，因此可被纯有机溶剂清 洗掉。
替米考星—C18
阿维菌素—Al-B 氯羟吡啶—AL-B 糖皮质激素—Silica
己烯雌酚—Silica
同化激素类
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Oasis® 2x4SM 方法一览
对有机酸、酚类 对有机碱: 对季铵碱、盐 对有机强酸 pKa 2-8 pKa 2-10 pKa >10 pKa <1.0 ® 选择 Oasis MCX 选择 Oasis® WAX 选择 Oasis® WCX 选择 Oasis® MAX
样品预提取:
取2g肾组织样, 加30 mL 50mM磷 酸缓冲液 (pH 7.4)进行组织匀浆, 然后在10000 rpm下离心10 min。 取上清液上萃取小柱。
Oasis® MAX
O
N + CH2NR3
小柱激活/平衡 1 mL 甲醇, 1 mL 5 N NaOH, 1 mL 水 上样 5 mL 上清掖 清洗步 #1 1 mL 5 % 氨水 清洗步 #2 1 mL 甲醇 淋出液 3 mL 4%甲酸-甲醇
SO3
pKa <<1
SO3
强阳离子交换作用
CH
+ N HH OH 3 CH 3
反相作用
普萘洛尔 （碱性药物）
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Oasis MCX SPE 吸附剂
净化和富集碱性化合物的强有力工具
(Oasis MCX 在所有pH下均带负电)
样品预处理
Bases (BH+) B Neutral k’
四环素类--HLB 氯霉素类--HLB 硝基呋喃类—HLB B-内酰胺类（青霉素）—HLB 氨基糖苷类—HLB 林可霉素—HLB 大观霉素—HLB 地塞米松—HLB B-受体激动剂类—MCX 磺胺类—MCX 地美硝唑/甲硝唑—MCX 阿苯达唑—MCX 金刚烷胺—MCX 地西泮及其代谢物—MCX 氟喹诺酮类—MCX& MAX 头孢噻呋—MCX&MAX 卡巴氧残留标示物—MAX 喹乙醇残留标示物—MAX 泰乐菌素—C18
兽药残留检测项目/SPE
四环素类--HLB 氯霉素类--HLB 硝基呋喃类—HLB B-内酰胺类（青霉素）—HLB 氨基糖苷类—HLB 林可霉素—HLB 大观霉素—HLB 地塞米松—HLB B-受体激动剂类—MCX 磺胺类—MCX 地美硝唑/甲硝唑—MCX 阿苯达唑—MCX 金刚烷胺—MCX 地西泮及其代谢物—MCX 氟喹诺酮类—MCX& MAX 头孢噻呋—MCX&MAX 卡巴氧残留标示物—MAX 喹乙醇残留标示物—MAX 泰乐菌素—C18
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改善的SPE方法：推荐用于UV，荧光或单四极质谱检测 －本底净化更好，但回收率略受影响
Oasis® MCX 30 mg (1 cc) Oasis® MAX 150 mg (6 cc) 用2 mL 含0.2 N HCl 的甲醇溶液 将待测物从 Oasis MAX 洗脱到 Oasis MCX (1 cc, 30 mg) 用2 mL甲醇清洗 Oasis MCX 用500 μL 含10% NH4OH 的甲醇洗脱 待测物至1ml样品管中 用甲酸调节至中性，用流动相稀释
+ CH2NR3
+ R3NCH2
N
O
溶剂蒸发、重新定容于 0.4 mL 流动相
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若以碱性官能团为目标: 选择Oasis® MCX 并执行方法1
对有机碱: pKa 2-10 选择 Oasis® MCX
H3 C
N
N N
套用方法1
样品预处理
F O
COOH
有机强酸
季铵碱、盐
有机酸、酚类
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例2： 猪肝和猪尿中β-受体激动剂残留检测气相色谱－质谱法农业部1031号公告-3-2008
猪肝： 1. 取样品5g+乙酸铵缓冲盐10mL 2. 均质1min 后加β-葡萄糖醛酸苷酶及内标60 ℃酶解2小时 3. 离心收集 4. 残渣+10mL乙酸铵缓冲盐振荡5min 5. 离心5min合并两次上清液 6. NaOH调PH至9.5后加入8gNaCl,振荡后待处理 猪尿： 1. 取样品5mL+1mL乙酸铵缓冲盐并用乙酸调PH至5.2 2. 加β-葡萄糖醛酸苷酶及内标60 ℃酶解2小时 3. NaOH调PH至9.5后加入8gNaCl,振荡后待处理 上述待处理液中加入乙酸乙酯：异丙醇（6：4），萃取两次， 60 ℃旋干后3mL乙酸 铵复溶后，待净化液过固相萃取柱
R1 OH R2 CH R4 R3
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H NH
CH3 R6 R5
Oasis® MCX 吸附剂上碱性化合物的作用模式: Mixed-Mode Cationic-eXchanger
MCX吸附剂
O N
Mixed Mode Cation eXchanger
H3 C
N
N N
套用方法2
样品预处理Leabharlann Baidu
F O
COOH
激活/平衡 上样
清洗: 5% 氨水 淋出段 1: 100% MeOH 淋出段 2: 2% 甲酸-MeOH
Enrofloxacin
有机酸
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在Oasis® MAX上提取动物组织中的氟喹诺酮类药物
(适宜LC/MS/MS分析)
N O
N
N
O
Oasis® WCX
Hydrophilic Retention of Polars
C O OH COO- + H+
Oasis® WAX
N N H N O H N+ N+ H H
N
pKa ~5 0.75 O meq/g
pKa ~6 0.6 meq/g
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例3，动物组织中Fluoroquinolone(氟喹诺酮类)药物的分析
H3 C
N
N N
Enrofloxacin
F
氟喹诺酮类药物是经合法注册使用的兽 药,但存在被滥用的趋势 允许残留限量为30ug/Kg 属两性化合物
– 酸官能团的pKa 约为 5 – 碱官能团的pKa约为8-9
COOH
O
无硅醇基活性 pH 应用范围 0-14 吸附剂干涸后对回收率和分析重现性全无影响 亲水性结构如同‘极性抓钩’，有助于保留亲水性物质 极高的比表面积, 比硅胶吸附剂用量减少2/3
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为什么选择Oasis HLB ？
优势：对极性化合物保留优异------以下实验数据来自上海CIQ
激活/平衡 上样
清洗: 2% 甲酸 淋出段 1: 100% MeOH
Enrofloxacin
淋出段 2: 5% 氨水-MeOH
有机碱
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以两SPE萃取小柱串联方式进一步提高样品纯化效率
阴离子态化合物在Oasis MAX载体上以离子 交换方式被强力锁定。
双柱串联 SPE Oasis® MAX + Oasis® MCX 单独用Oasis MAX SPE小柱
样品净化的目标
样品净化的水平 检测技术
*GC typically requires a higher level of sample cleanup even for multi-residue analyses
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Oasis® 系列固相萃取吸附剂
Oasis® HLB
替米考星—C18
阿维菌素—Al-B 氯羟吡啶—AL-B 糖皮质激素—Silica
己烯雌酚—Silica
同化激素类
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例1：水产品中青霉素检测GB29682-2013
本标准适用于鱼可食性组织中青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素 单个或多个药物
水中溶解度与pH值相关
– 中性pH下微溶 – 酸性、碱性pH下溶解度增大
可用复合模式SPE来进行样品净化
– pH>7时利用阴离子交换机制 – pH< 6时利用阳离子交换机制
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若以酸性官能团为目标: 选择Oasis® MAX 并执行方法2
对有机酸、酚类 pKa 2-8 选择 Oasis® MAX
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固相萃取柱净化过程—— WATERS Oasis MCX小柱(3cc/500mg)
1.活化——依次过5mL甲醇和5mL水以及5mL30mmol/L的盐酸活化
2.上样及清洗——待净化液过柱，用5 mL 水及5mL甲醇清洗并抽干 3.洗脱——用6mL5%氨水甲醇洗脱收集，50 ℃氮吹干 4.衍生：BSTFA+甲苯
套用方法1
样品预处理
套用方法2
样品预处理
激活/平衡 上样
清洗: 2% 甲酸 淋出段 1: 100% MeOH 淋出段 2: 5% 氨水-MeOH
激活/平衡 上样
清洗: 5% 氨水
中性物质
淋出段 1: 100% MeOH 淋出段 2: 2% 甲酸-MeOH
有机碱
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活化 1 mL 甲醇, 1 mL 5 N NaOH, 1 mL 水 Load 5 mL 样品
Wash #1 1 mL含 5 % 氨水的水溶液 Wash #2 1 mL 甲醇 Elute
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以双小柱串联方式大大提高样品洁净度 实现以低端仪器测试痕量兽药
Water wettable Stable across pH 1-14 No silanol interactions
Oasis® MCX
SO3
Oasis® MAX
CH3
O
pKa <<1 1 meq/g
+ 4H9 CH2N-C
CH3
pKa > 18 0.25 meq/g
Lipophilic RP Retention