溶磷检测

1、溶磷检测：

基本原理：正磷酸盐在酸性溶液中与钼酸铵作用生成磷钼酸铵,再用抗坏血酸（Vc ）使之还原成钼蓝,其反应如下:

2H 3PO 4+24（NH 4）2MoO 4+21H 2SO 4+2H 2O 2（NH 4）3PO 4·12MoO 3·2H 2O+21（NH 4）2SO 4+24H 2O

2（NH 4）3PO 4·12MoO 3·2H 2O+10H 2O+还原剂（Vc ） 2{（NH 4）3·（H 2O ）4·[P （Mo 2O 7）]}（铜盐） 制定磷标准曲线

取一定量KH 2PO 4（A.R ）置于称量瓶内，105℃烘箱中干燥3个小时，精确称量0.439g KH 2PO 4，加0.1NH 2SO 420ml ，溶解后，稀释至100ml 容量瓶中，得1000μg/ml 磷标准溶液。吸取上述标准液1ml 于100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容，得10μg/ml 磷标准溶液。按下表依次在各管内加入不同量的磷酸盐标准溶液和试剂，充分摇匀后于45℃水浴20分钟，冷却后，于660nm 波长测量OD 值，计算回归方程。

表3-1 磷标准溶液配制表

Table 3-1 Form for preparing phosphorus standard solution

管号 10 μg/ml 磷标

准溶液（ml ） 含磷量（μg ）

蒸馏水（ml ） 定磷试剂（ml ） 水浴时间（min ）

OD 660

1 0.0 0 3.0 3.0 45℃水浴保温20min

2 0.5 5 2.5 3.0

3 1.0 10 2.0 3.0

4 1.

5 15 1.5 3.0 5 2.0 20 1.0 3.0

6 2.5 25 0.5 3.0

7 3.0

30

0.0

3.0

测定发酵液样品

取发酵上清液1ml （培养基灭菌前灭菌后样取0.2 ml ）至试管中，加2 ml （2.8 ml ）蒸馏水，再加3 ml 定磷试剂，按标准曲线同样步骤操作，以空白作对照，660nm 波长测OD 值。根据磷标准曲线计算发酵液溶磷含量（µg/ml ）。（取样品0.2 ml 时，以上数据乘5倍）

定磷试剂的配制

6NH 2SO 4:水:2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=1:2:1:1（V/V ）

此试剂要现配现用，配好后试剂应呈黄绿色或黄色，如呈棕黄色或深绿色倒去。

（2.5%钼酸铵和10%抗坏血酸置4℃冰箱内保存）

2、发酵液氨基氮的测定方法

测定氨基氮

取发酵上清液2.5ml至250ml三角瓶中，加蒸馏水50ml，甲基红指示剂2滴，1M HCl 1-2滴，调节溶液至红色，静置5分钟，再用0.037M NaOH调节溶液至橙色（体积不计），使成中性。加12%中性甲醛溶液10ml（每次用之前用NaOH调至微红色，酚酞作为指示剂），摇匀静置10分钟。加1%酚酞指示剂1ml，用0.037M NaOH标准溶液滴定至微红色为终点。

氨基氮（mg/100ml）= M NaOH×V NaOH×14.01×40。

M NaOH：NaOH物质的量浓度（mol/L）V NaOH：消耗的NaOH体积数（ml）氨氮测定试剂：

0.1%甲基红指示剂：称取0.1g甲基红，溶于100ml 95%乙醇中，摇匀即可。

0.03569M NaOH：量取1M NaOH 357ml于10000 ml试剂瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀标定。

标定：精确称取经研细并在105℃烘烤至恒重的G.R临苯二甲酸氢钾0.15——0.17克至三角瓶中,加蒸馏水50 ml溶解后，以酚酞为指示剂，以NaOH滴定至红色，30秒内不褪色为准。

计算：NaOH浓度（mol/L）=W KHC8H804 /（V NaOH*0.2042）

W KHC8H804：临苯二甲酸氢钾质量（g）V NaOH：NaOH消耗体积数（ml）0.2042为临苯二甲酸氢钾的毫克当量。

中性甲醛：用36-40%甲醛加2倍水稀释（如浑浊需过滤），临用前用NaOH调至微红色（酚酞为指示剂）。

0.5%酚酞：称取2.5g酚酞溶于500ml 95%乙醇中，摇匀。