实验二___高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法测定咖啡因
一、实验目的
1.掌握高效液相色谱法的基本原理。 2.了解高效液相色谱仪的使用及日常维护。 3.掌握标准曲线法定量实验技术。
二、实验原理
咖啡因，化学名为1，3，7—三甲基黄嘌呤。 它是一种中枢神经兴奋剂，能兴奋大脑皮层， 使人精神兴奋，目前可由茶叶及咖啡中提取， 咖啡因的甲醇溶液在270nm波长下有最大吸 收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比， 从而进行定量。
五、数据处理及结果
可乐型饮料中咖啡因含量（mg/L）= C/ 20 ×1000 咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量（μg/g） = C/ m ×稀释倍数（50×1000/20） C— 由标准曲线查得相当于咖啡因的含量，μ g ； m—样品的质量，g
四、实验步骤
2. 标准曲线的绘制 准确移取咖啡因标准应用液（0.2 mg/mL）0、5.0、10.0、 15.0、20.0μL分别注入色谱仪中，得到相应的峰高或峰面积， 以质量为横坐标，峰高或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 3. 测定 流动相： 甲醇∶水∶乙睛 = 40∶50∶10（V/V） 流速：0.6ml/min 色谱柱：ODSC18 （4.6mm×150mm） 紫外检测器（270nm） 柱温：40℃
三、仪器与试剂
1. 仪器 液相色谱LC—10AVP，紫外检测器，超声波发生器 2.试剂 氯仿（GR）甲醇（GR）乙睛（GR）咖啡因标品 咖啡因标准储备液（1.0mg/ml）：准确称取50 mg咖
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
啡因于50mL比色管中，用色谱纯甲醇定容至刻度，摇匀。
咖啡因标准应用液（0.2mg/ml）：移取咖啡因标准储
备液10.0ml于50ml比色管中，用色谱纯甲醇定容至刻度，摇 匀。
可乐咖啡因测定实验报告
一、实验目的1. 学习高效液相色谱法（HPLC）的基本操作和原理；2. 掌握咖啡因含量测定的标准曲线法；3. 了解可乐饮料中咖啡因含量的测定方法及其意义。
二、实验原理咖啡因是一种具有药理活性的物质，广泛存在于可乐饮料、咖啡和茶叶中。
适量摄入咖啡因具有提神、兴奋神经等作用，但过量或长期摄入咖啡因可能对人体健康产生不利影响。
本实验采用高效液相色谱法测定可乐饮料中咖啡因含量，以期为消费者提供参考。
高效液相色谱法（HPLC）是一种高效、灵敏的分析方法，具有分离度高、检测限低、分析速度快等优点。
本实验采用HPLC法测定可乐饮料中咖啡因含量，通过比较标准曲线与样品峰面积，计算出样品中咖啡因的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：市售可乐饮料、咖啡因标准品、甲醇、乙腈、磷酸二氢钠等；2. 仪器：高效液相色谱仪、超声波清洗器、电子天平、移液器、离心机等。
四、实验方法1. 标准曲线制备：准确称取一定量的咖啡因标准品，用甲醇溶解并配制成一系列浓度的标准溶液。
将标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品前处理：准确吸取一定量的可乐饮料，加入适量甲醇，超声处理一定时间，待溶液澄清后，离心分离。
取上清液进样。
3. HPLC分析：根据实验要求，选择合适的色谱柱、流动相、流速、检测波长等条件，进行HPLC分析。
4. 数据处理：将样品峰面积与标准曲线进行比对，计算出样品中咖啡因的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：本实验制备的标准曲线线性范围为0.5～30 mg/L，相关系数为0.9999，说明该方法具有良好的线性关系。
2. 样品测定：根据标准曲线，计算出可乐饮料中咖啡因的含量。
3. 结果分析：本实验测定的可乐饮料中咖啡因含量与市售可乐饮料标签标注的咖啡因含量基本一致，说明该方法能够准确测定可乐饮料中咖啡因含量。
六、实验结论1. 本实验采用高效液相色谱法测定可乐饮料中咖啡因含量，操作简单、快速、准确，具有良好的重复性和重现性；2. 该方法为消费者了解可乐饮料中咖啡因含量提供了一种有效的检测手段。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物 。
高效液相色谱法测定饮 料中咖啡因的含量
2020年8月1日星期六
102.2 实验原理
• 咖啡又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称 为l,3,7-三甲基黄嘌呤，是由茶叶或咖啡中提取而得的 一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡 中含咖啡因约为l.2%～1.8%，茶叶中约为2.0%～4.7%。 可乐饮料、APC药片均含咖啡因。其分子式为C8H10O2N4, 结构式为：
•102.4 注意事项
• （1）钢瓶的工作压力，一定要控制在所规定范围 内，不得超压工作。必须切记，保障安全。 • （2）实验结束后，检查仪器是否正常，关闭是否 正确。
•102.5 问题讨论
•
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
•102.6 参考答案
• 5．将进样阀从装载（LOAD）位转向进样（ 1NJECT0位，同时按标记钮(MARKER)，使在记录纸上打 开进样信号。 • 6．当咖啡因的色谱峰出完后，按照步骤4～5连续 操作2次，使最低浓度的标准试液获得3张色谱图。 • 7．按标准试液浓度增加的顺序，按步骤4～6操作 ，使每一种标准样获得3个数据。 • 8．取2 mL咖啡饮料试液放入25 mL容量瓶中（或 取5 mL茶液放入50 mL容量瓶中），分别用流动相稀释 至刻度。 • 9．按步骤4～6操作，分析饮料试液（咖啡或茶） 。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
仪器分析实验：高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量
六通阀进样器
转动手柄
实验前期准备工作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
❖咖啡因标准溶液的配制: 1.配制1000mg/mL咖啡因储备液 2.分别用吸量管吸取1000mg/mL咖啡因储
备液0.25、0.5 、1.0、2.0、3.0mL于5只 50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度。
样品前处理： 1.可乐（脱气除二氧化碳） 2.咖啡（用水定容） 3.干过滤 4.0.45mm 滤膜过滤
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支以液体为流动相采用高压输液系统将具有不同极性的检测物通过单一溶剂或不同比例的混合溶剂缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱在柱内各成分被分离后进入检测器进行检测从而实现对试样的分析
高效液相色谱法 测定饮料中咖啡因含量
吉林大学化学教学中心
实验意义
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学 名称 1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡 中提取而得的一种生物碱。它能兴奋大脑皮 层，使人兴奋。咖啡中含咖啡因1.2%-1.8%， 茶叶约含2.0%-4.7%。可乐、APC药片中均含 咖啡因。其分子式为：C8H10O2N4,结构式为
高效液相色谱法的分离原理
基本原理：利用组分在两相间分配系数不同而 进行分离的技术； 流动相：携带样品流过整个系统的流体； 固定相：静止不动的一相，色谱柱。
反相模式（RP）的相互作用力
C18(ODS,十八烷基硅烷键合相硅胶(ostade-cylsilane) 疏水性
液相色谱简易流程图
检测波长： 275nm
实验过程
1.将已配置的浓度不同的咖啡因标准溶液进 入色谱系统，以紫外检测器检测，绘制出标 准曲线。
2 . 进样品样，利用外标法测定样品中咖啡 因的含量。
实验目的
1.了解HPLC测定咖啡因的基本原理； 2 . 掌握高效液相色谱仪的操作； 3.掌握HPLC法进行定性及定量的基本方法; 4.掌握标准曲线定量法。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量【开题报告】
毕业设计开题报告应用化学高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量一、选题的背景和意义咖啡因（Caffeine ）是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱。
茶、咖啡、可乐这三大非酒精饮品和许多功能饮料都有咖啡因成分。
适量摄入咖啡因对人体是有益的，如可以缓解工作压力，起到提神醒脑作用等。
但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，虽然其成瘾性较弱，戒断症状也不十分严重。
因此也被列入受国家管制的精神药品范围。
所以每人每天咖啡因的摄入量不宜过高。
摄入咖啡因量可分为以下等级:成人每天摄入80 ～250 mg 咖啡因( 1.1 ～3.5 mg/kg·d- 1 ) 为低摄入量, 300 ～ 400 mg ( 4 ～6 mg/kg·d- 1 )为中摄入量，超过500 mg(7mg/kg·d- 1 )为高摄入量。
滥用咖啡因通常也有吸食和注射两种形式，其兴奋刺激作用及毒副反应、症状、药物依赖性与苯丙胺相近。
咖啡因是受国家管制的精神药品。
作为中枢兴奋药中的清醒药,低、中摄入量时能够振奋精神、提高注意力、增强自信心、提高工作效率、减少疲乏感、增强识别能力、提高瞬时口头记忆力。
而高摄入量的咖啡因可引起焦虑、烦躁、失眠、易怒及精细运动功能受损。
作为中枢神经系统兴奋药，小剂量能兴奋大脑皮质，改善思维活动,提高对外界的感应性。
大剂量则可兴奋延髓的呼吸中枢和血管运动中枢,增加呼吸频率和深度。
已有研究表明大量摄入咖啡因容易上瘾 ,导致慢性中毒,引起众多严重后果,如影响睡眠, 引起局部缺血性心脏病，出现心律不齐、心悸及心动过速，降低女性受孕率，提高孕妇自然流产率和致畸率，引发阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝脏、胃、肾等器官,诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤疾病等。
目前测定咖啡因的方法很多,如薄层色谱法、紫外分光光度法和高效液相色谱法。
前两种方法样品预处理过程比较复杂； HPLC法灵敏、快速、准确,样品预处理较简单,可广泛用于咖啡因含量的测定，对于确保人类健康有着重要的意义。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量在日常生活中，饮料是我们常见的饮品之一。
而咖啡因作为许多饮料中的一种重要成分，其含量的测定具有重要的意义。
高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于分析化学领域的技术，它能够准确、快速地测定饮料中咖啡因的含量。
咖啡因，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，是一种天然存在于咖啡、茶、可可豆等植物中的生物碱。
由于其具有兴奋神经中枢、提高警觉性和缓解疲劳等作用，被广泛添加到各种饮料中，如咖啡、茶饮料、可乐等。
然而，过量摄入咖啡因可能会对人体健康造成一定的影响，如失眠、焦虑、心悸等。
因此，准确测定饮料中咖啡因的含量对于保障消费者的健康和权益至关重要。
高效液相色谱法是一种基于液体流动相和固定相之间的分配作用来分离混合物中各组分的方法。
它具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，适用于各种复杂样品的分析。
在测定饮料中咖啡因的含量时，高效液相色谱法通常采用反相色谱模式，即以非极性的固定相和极性的流动相进行分离。
首先，样品的前处理是测定的关键步骤之一。
对于饮料样品，一般需要进行适当的稀释和过滤，以去除其中的杂质和颗粒物，避免对色谱柱造成堵塞和污染。
对于一些含有较多色素和糖分的饮料，可能还需要进行萃取或固相萃取等净化处理，以提高分析的准确性和可靠性。
在进行高效液相色谱分析时，需要选择合适的色谱柱、流动相、检测波长等条件。
常用的色谱柱有 C18 柱，其具有良好的分离性能和稳定性。
流动相通常由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈）组成，并添加适量的酸（如磷酸、乙酸）来调节 pH 值，以改善色谱峰的形状和分离效果。
检测波长一般选择在 270 280nm 之间，因为咖啡因在这个波长范围内有较强的吸收。
仪器设备方面，高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统和数据处理系统组成。
输液系统负责输送流动相，使其以稳定的流速通过色谱柱；进样系统用于将样品准确地引入色谱柱；色谱柱是分离的核心部件；检测系统用于检测分离后的组分，并将其转化为电信号；数据处理系统则对检测信号进行采集、处理和分析，最终给出样品中咖啡因的含量。
超高效液相色谱测定饮料中咖啡因的含量
咖啡 因（ Ｃ ａ ｆ ｆ ｅ ｉ ｎ ｅ ） 又称咖 啡碱 ， 属黄嘌呤衍 生物 ， 化学名称 １ ， ３ ， 液， 经微 孔滤膜过滤 ， 滤液 待上机分析 。 １ ． ５色谱 分析 条件 ７ 一 三 甲基黄嘌 呤 ， 为 白色无臭味苦的发亮针丝状或粉末结晶。 熔点 为２ ３ ４ － ２ ３ ８ ℃， １ ７ ８ ℃升 华 ， 能溶于 乙醚 、 丙酮 、 氯仿 、 水， 微溶于 石油 色谱柱 ： ＡＣ Ｑ ＵＩ Ｔ Ｙ—ＵＰ ＬＣ ＢＥ Ｈ Ｃ １ ８ １ ． ７ ｕ ｎ， ｒ 柱温 ： ４ ０ ＂ Ｃ， 醚。 是从 茶叶、 咖啡果 中提炼 出来的一种生物碱 ， 适度地使用有祛除 流速０ ． ３ Ⅱ Ⅱ ／ Ⅱ ｌ ｉ ｎ ， 检测波 长： ２ ８ ６ ｎ ｍ， 进样 量 ： ５ ｕ ｌ ， 流动相为 甲醇 ： 水 疲劳 、 兴奋神经的作用 ， 临床上 用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。 小量 ＝１ ０ ： ９ ０ ， 到３ ａｉ ｒ ｎ， 甲醇 由１ ０ ％ 增 加到９ Ｏ ％， 到４ ａｉ ｒ ｎ ， 再变成 甲醇 ： 水
２结果 与 讨论
１实验 部 分
１ ． １试 剂与 材料
在 同一样品 中添加浓度为２ ０ ｍｇ ／ Ｌ ， ５ ０ ｍｇ ／ Ｌ 进行 回收率试验 ， 同一样品重复进行６ 份测定 ， 观察峰面积 ， 统计数据 的重复性 ， 结果
甲醇 ： 色谱纯 。 亚铁氰 化钾溶液 ： 称取 １ ０ ６ ｇ 亚铁氰 化钾【 Ｋ Ｆ ｅ 得 出回收率和Ｒ Ｓ Ｄ均在允许范 围之 内（ 如表 １ ） 。 （ ＣＮ） ． ３ Ｈ， Ｏ】 加水至 １ Ｏ ０ ０ ｍｌ 。 乙酸 锌溶 液 ： 称取２ ２ ０ ｇ乙酸锌 ３结 语
（ ２ ） 咖啡因标准使用液 ： 准确吸取不同体积咖啡因标准储备液 ， 将 ［ １ ］ 中华人 民共和 国国家标准， Ｇ Ｂ ／ Ｔ ５ ０ ０ ９ ． １ ３ ９ － ２ ０ ０ ３ ， 饮料 中咖啡因的 其稀释成咖啡 因含量分别为ｌ ｕ ｇ ／ ｉ ｎ ｌ ， ｌ Ｏ ｕ ｇ ／ ｍＩ ， ２ ０ ｕ ｇ ／ ｍｌ ， ５ ０ ｕ ｇ ／ ｍ ｌ ， 测定． １ Ｏ Ｏ ｕ ｇ ／ ｍｌ ， ２ ０ ０ ｕ ｇ ／ ｍｌ 的标 准使用液 。 ［ ２ ］ 华东理工大学， 成都科技大 学． 分析化学（ 第四版） ［ Ｈ ］ ． 北京： 高等教 １ ． ３仪 器 与设 备 育 出版 社 。 ｌ ９ ９ ５ ： ３ ２ ４ ．
饮料中咖啡因的高效液相色谱分析
实验21 高效液相色谱法测定饮料中咖啡因【实验目的】1. 熟悉反相色谱法的工作原理和应用；2. 学习液相色谱仪的基本结构和基本操作；3. 掌握高效液相色谱法定性、定量分析的原理和方法。
【实验原理】1. 基本原理色谱法的实质是一种物理化学分离、分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，经过反复多次的分配实现组分分离。
根据各组分在色谱图上的保留时间（或保留距离），可直接进行组分的定性分析；测量各峰的峰面积或峰高，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。
高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱理论，并在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器从而实现分离分析的方法。
根据使用的固定相及分离机理不同，高效液相色谱法分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
（1）正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱。
（2）反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物，被分离组分按极性从大到小的顺序流出。
液-液分配色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。
反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
2. 咖啡因咖啡因又称咖啡碱，由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋，被广泛应用于食品、饮料的生产工艺中，成为各种功能性饮品的重要成分之一。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
• 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光 度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他 组分（如：单丁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配 制的浓度不同的咖啡因标准溶液也注入色谱系统。如流 速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在
色谱图上的保留时间tR（或保留距离）或峰面积A后，可 直接用tR定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的 含量
•102.6 参考答案
• （1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。 • 答：反相柱n-C18,是将非极性物质n-C18烷（正构
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的 含量
•102.3 操作流程
• 1．标准储备液的配制：准确称取25.0 mg咖啡因标准试 剂，用配制的流动相溶解，转入100 mL容量瓶中，稀释至刻 度。 • 2．用标准储备液配制质量浓度分别为25 g/mL，50 g/mL，75 g/mL，100 g/mL，125 g/mL系列标准溶液。 • 3．启动泵，打开检测器，设置泵的流速为2.3 mL/mm， 检测器的灵敏度设在0.08 AUFS，打开记录仪，将纸速设在1 cm/min。当流动相通过色谱柱约5～10 min．记录仪上基线稳 定后，开始进样。 • 4．将进样阀放在半截（LOAD）位时，用注射器取25 L 浓度最低的标准样（比进佯阀上定量管多5 L以上)，注入进 样阀中。
试验2高效液相色谱法测定可乐中的咖啡因含量
实验2、高效液相色谱法测定可乐中的咖啡因含量一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作；2、掌握标准曲线法（外标法）定量分析的方法；3、掌握UV检测器的工作原理及应用范围。
二、实验原理根据朗伯－比尔定律（A=abc）：在一定浓度范围内，样品中被测组分的含量与响应值（峰面积或峰高）成正比。
用标准物质配制一系列不同浓度的标准样品，在一定的色谱条件下，分别测定标准样品和试样的峰面积，以标准溶液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，采用最小二乘法回归得到被测样品标准曲线的方程；将测得试样的峰面积代入方程，计算得到试样中咖啡因的含量。
三、仪器、试剂及色谱条件仪器：Agilent 1200 HPLC；C18高效液相色谱柱，Φ 4.6mm×15cm，填料粒度5μm；紫外光检测器（DAD）；微量进样器（25μL）；色谱条件：流动相：甲醇：水=65：35（V/V），1mL/min；检测波长：254nm；色谱柱温度：30℃；进样量：10μL。
试剂：无水甲醇、咖啡因（均为分析纯试剂）、市售可乐、超纯水。
四、实验步骤1、流动相的配制：甲醇、水分别须经0.45微米有机膜、水相膜过滤后使用；2、流动相脱气：将流动相置于超声波清洗器上脱气15min（本机配自动脱气装置，脱气过程略）；3、标准溶液的配制：配制咖啡因含量为20、40、80、160、320μg/mL的甲醇溶液；4、按仪器操作说明打开计算机和主机，进入色谱工作站，设定色谱条件；5、启动色谱系统，调整仪器基线，待基线稳定即可进样；7、用进样器分别抽取10.0μL系列标准液及样品，排出注射器中气泡，插入六通阀的进样孔进样，仪器自动开始采集、保存数据；8、实验结束后，用纯甲醇清洗色谱柱及进样器，关闭仪器。
五、数据处理及实验结果以标准溶液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，采用最小二乘法回归得到标准曲线方程，计算可乐中咖啡因的含量，实验结果见下表。
HPLC测定可乐中咖啡因含量实验结果表六、思考题1、标准曲线法定量准确度的影响因素有哪些？2、为什么流动相必须要经过脱气、过滤处理？3、紫外检测器适合于分析那些种类的物质？实验、GC-MS定性分析混合溶剂的成分一、实验目的1、学习GC-MS的基本操作；2、掌握GC-MS的构成及工作原理；3、了解谱库检索法定性分析有机化合物的方法。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因和含量
液 相
色
行校正，这就是校正因子的意义。由于校正因子f′与色谱
谱 法
测
操作条件有密切关系，不易准确测定（不是一个定植），因
定 饮
料
此，在色谱分析中采用相对校正因子fi，既被测物质i和标
中 咖
啡
准物质s绝对校正因子的比。
因 的
含
量
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
高 效
液
构式为：
相 色
谱
法
测
定
饮
料
中
咖
啡
因
的
含
量
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
大
学
通
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光
用 化
度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他
学 实
组分（如：单丁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配
验 技
制的浓度不同的咖啡因标准溶液也注入色谱系统。如流 术
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
大
学
通
用
102.6 参考答案
化 学
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
实 验
答：反相柱n-C18,是将非极性物质n-C18烷（正构
技 术
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 8/9
高
动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单
料
中
咖
啡
因
的
含
量
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
大
学
通
用
102.5 问题讨论
化 学
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
高效液相色谱-二极管阵列检测饮料中咖啡因的含量
照 ２．２．３样 品制 备样 品 溶 液 ，液 相 色 谱 外 标 法 定 量 。 由 表 ３中可 知 回 收 率 在 ９８．４８％ ～ １０１．２％ 之 间 ，平 均 回 收 率 为 ９９．６１ ，表 明高 效 液 相 色 谱 一 二极 管 阵 列 检 测 饮 料 中咖 啡 因含 量 具 有 良好 的准 确 性 。
准 确 称 取 ５ ｇ饮 料 盲 样 ，用 水 稀 释 定 容 到 １０ ｍＬ， 过 ０．４５“Ｉｎ微孔 滤 膜 待 测 。
３ 结果 与讨论
３．１ 流 动 相 选 择 本 文 采 取 了 甲醇 ＋ 水 一 ３０：７０，甲 醇 ＋ 水 一 ２４：
７６，甲醇 ＋水 一２Ｏ：８０，逐 步 降 低 甲醇 比例 ，发 现 甲醇 比 例 达 到 ３Ｏ 分 离 度 较 好 ，能 够达 到 实 验要 求 。 ３．２ 检 测 波 长 的 选 择
中 图 分 类 号 ：ＴＳ２７５
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７４—９９４４（２０１８）２０—０２００—０２
１ 引 言
咖 啡 因 属 于 一 种 黄 嘌 呤 生 物 碱 化 合 物 ，能 够 起 到 中 枢 神 经 系 统 兴 奋 作 用 从 而 消 除疲 劳 ，其 广 泛 存 在 于 咖 啡 、茶 、软 饮 料 中 ，国 家 标 准 ＧＢ／Ｔ ２１７３３— ２００８ｌ＿４ 规 定 饮 料 中 咖 啡 因 含 量 不 低 于 ２０ｍｇ／ｋｇ，所 以含 有 咖 啡 因 的 饮 料 在 市 面 上 很 受 欢 迎 。 二 极 管 阵 列 检 测 器 （Ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＤＡＤ）能 够 做 咖 啡 因 的 全 波 长 扫 描 光 谱 ，从 而 确 定 咖 啡 因 的 最 大 吸 收 波 长 ，比紫 外 检 测 器 用 途 广 泛 。本 文 采 用 液 相 色 谱 一 二 极 管 阵 列 检 测 饮 料 中 咖 啡 因 的 含 量 并 做 了相 关 研 究 。
高效液相色谱法测定可口可乐中咖啡因的含量--
高效液相色谱法测定可口可乐中咖啡因的含量姓名：学号：前言高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广、色谱柱可反复使用的特点。
咖啡因（Caffeine ）是日常饮料中主要成分，据查验，1g雀巢咖啡含35咖啡因，1g茶含20-35mg，而1000ml可乐饮料中含90-100mg[1]。
咖啡因亦称咖啡碱，是一种甲基黄嘌呤，属生物碱类物质，化学名称为l，3，7一三甲基一3，7一二氢一1H一嘌呤一2，6一二酮水合物，化学式C。
H。
N。
0：，相对分子质量为194．2，易溶于水、乙醚、氯仿、二氯甲烷，能溶于乙醇、丙酮、醋酸乙酯，难溶于乙醚和苯，熔点为235～237℃，白色结晶粉末，无臭，味苦，有风化性[2]。
咖啡因是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱，属黄嘌呤类，药理作用相似，咖啡因的中枢兴奋作用较强，临床主要用作中枢兴奋药。
适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。
但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，被列入受国家管制的精神药品范围。
化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
常用来测定咖啡因的方法有滴定法[3]，紫外分光光度法[4]，高效液相色谱法[5]，气相色谱法[6]，毛细管电泳法[7]等。
1试剂、仪器和药品仪器：KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司；AL204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；Waters-2695高效液相色谱仪（美国；试剂：甲醇为色谱纯、超纯水；样品：可口可乐饮料(市售)；对照品：咖啡因(原料药)；2色谱条件1.色谱柱：INERTSIL-ODS-SP-18( 4.6×150mm，5um)；2.流动相：甲醇：水=35:65（V/V）；3.流速：1ml/min；4.检测波长：270nm；5.柱温：25℃。
高效液相色谱法测定咖啡因的含量
高效液相色谱法测定咖啡因的含量
实验目的
1．学习高效液相色谱仪的基本结构和基本操作。 2．了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3．掌握采用高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方 法。
实验原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱法，它是 利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流动相相间分配系 数或吸附系数的差异，将各组分分离后进行定性、定量分 析。本实验以咖啡因为测定对象，以反相HPLC来分离检测 未知样中咖啡因的含量。用反相液相色谱法将咖啡因分离。 以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线。 再根据样品中咖啡因的峰咖啡因标准溶液。 2．打开电脑，开仪器（由上至下）点开Instrument Online调整流动相流量，打 开Purge阀，排气泡，然后调小流量，观察基线是否平稳。 3．待基线平稳后，选择参数，设定方法。用待进样溶液清洗过的平头微量注射 器，吸取25μL溶液，进样。由小到大测定标准溶液的浓度，以色谱峰面积对 其浓度做工作曲线。 4．测定两个未知浓度样品的峰面积，从工作曲线上求出未知浓度样品的浓度。 5．关机。先关仪器（从下至上），再依次关工作站和电脑。 6．数据处理。
仪器与试剂
1．Agilent 1100高效液相色谱仪；XDB-C8色谱柱（4.6 mm×150 mm）； 填料粒径 5μm；25μL平头微量注射器。 2.容量瓶（100mL、10mL）；移液管 3．系列咖啡因标准溶液 准确称取25mg咖啡因标准试剂置于100mL烧杯中，定容至100mL容 量瓶中，摇匀。分别吸取1mL、2mL、3mL、4mL标准溶液于10mL容量瓶 中，定容至刻度，摇匀。未知浓度咖啡因溶液2组。 4．流动相 20%甲醇 + 80%二次蒸馏水
实验二 HPLC法测定咖啡因的含量
实验二高效液相色谱法测定咖啡因的含量一、实验目的1．熟悉高效液相色谱仪的基本结构和操作方法。
2．熟悉高效液相色谱的定量方法（标准曲线法）。
二、实验原理液相色谱法就是同一时刻进入色谱柱中的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复多次（103～106次）地分配过程，使得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在色谱柱中的移动速度就不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来，最后按顺序流出色谱柱而进入信号检测器，在记录仪上或色谱数据机上显示出各组分的色谱行为和谱峰数值。
测定各组分在色谱图上的保留时间（或保留距离），可直接进行组分的定性；测量各峰的峰面积，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。
高效液相色谱仪是实现液相色谱分离分析过程的装置。
高效液相色谱仪系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。
本实验采用十八烷基化学键合相作固定相，甲醇/水或乙醇/水作流动相，采用标准曲线法进行咖啡因的定量测定。
咖啡因为白色或带极微黄绿色、有丝光的针状结晶；无臭，味苦；为中枢兴奋药。
三、实验仪器与试剂液相色谱仪（岛津2010），50uL微量注射器，ODS C18柱，重蒸水，色谱甲醇，含咖啡因水样品。
四、实验步骤1．实验条件固定相：ODS C18柱；流动相：甲醇-水(60-40)；流速 1.0 ml/min；检测波长：254nm；柱温：室温。
五、咖啡因含量测定（1）标准曲线的绘制在5只50ml容量瓶中，分别加入一定量的1000 mg/L咖啡因标准溶液，以重蒸水定容至刻度线，摇匀，得到20mg/L 、40mg/L、80mg/L、160mg/L和320mg/L 标液浓度。
然后用微量注射器准确抽取5.0 μL溶液，注射入进样口。
注意不要将气泡抽入针筒。
在相同的色谱条件下，分别测定各标准溶液。
反相高效液相色谱法测定可乐中咖啡因的含量
图1咖啡因的结构式
图2色谱前处理柱
2结果与讨论
2.1色谱条件的选择优化
本方法的主要目的就是检测可乐中咖啡因的含量,我们采用美国
沃特斯公司的Diomonsil C18(2)5u色谱柱,实验表明该色谱柱对咖啡
因有很好的分离性能。
通过选择比较不同的波长条件,发现咖啡因甲醇溶液在286nm
波长下有很大的吸收且与其他物质的吸收峰很好的分开,所以选择
286nm为测定波长。
通过选择比较不同的淋洗液体系,发现甲醇/水体系能够很好的
分离咖啡因,不会出现峰拖尾,鬼峰以及其他峰不完全分离的情况,经
)作为流动
图3咖啡因色谱图
甲醇/水(4:1,流速1ml.min-1)
2.2方法的精密度、线性关系和检出限
配制浓度为10、20、50、100、150ug/mL的咖啡因甲醇标准溶液,每个浓度在286nm波长下测定6次峰面积响应值,RSD在0.18%~ 1.36%之间,分别测定不同浓度的咖啡因标准溶液的吸光度值,咖啡因浓度在10~150ug/L范围内与峰面积值呈良好线性关系,Y=1.7×104 X-9.99×103,相关系数为0.9998,方法检出限为为0.72ug/mL。
2.3实际样品测定
我们以不同品牌的可乐饮料为实验对象,测定其中含有的咖啡因,含量见表1。
表1实际样品测定结果及回收率中的咖啡因。
样品本法平均测定值/(%)RSD/%加标回收率。
饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析
实验八饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析一、实验目的1．进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。
2．巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。
3．掌握外标法定量及Origin软件绘制标准曲线。
二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。
可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，结构式为：NN N NOO3H3C CH3在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。
反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。
本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。
三、实验仪器和试剂1.岛津LC-20A高效液相色谱仪2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。
3. 咖啡因标准溶液的配制（1）标准贮备液配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液（实验室准备）。
（2）标准系列溶液用上述贮备液配置含咖啡因10 ug/mL，20 ug/mL，40 ug/mL，50 ug/mL，60 ug/mL的甲醇溶液，备用。
4. 试样市售的可口可乐和百事可乐四、实验条件）颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm1. 色谱柱（XDB-C182. 流动相甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 0.5-1 mL/min3. 检测器紫外光度检测器，270 nm4. 进样量 10 uL五、实验步骤1.制备所需的流动相，有机溶剂用0.45µm的有机滤膜过滤，水溶液用0.45µm 的水滤膜过滤，于超声波发生器上脱气20 min.2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.3. 打开A泵、B泵、检测器、柱温箱及电脑的电源开关。
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高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量
院（系）生化系年级2009级专业制药工程
姓名吴雄辉学号0940902007
课程名称基础化学实验报告实验日期2011年12月日
实验地点3L 5楼指导教师夏湘黄玉
一．实验目的
（1）熟悉高效液相色谱仪的结构，理解反相HPLC的原理和应用；
（2）掌握外标定量法。
二．实验原理
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%-1.8%，在茶叶中约为2.0-4.7%。
可乐饮料、止痛药等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：
在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法。
该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。
本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，用紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中咖啡因的峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
三．实验用品
仪器：高效液相色谱仪、恒流泵、超声波清洗仪、紫外光检测器等。
试剂：甲醇（分析纯）、咖啡因（分析纯）、二次蒸馏水
咖啡因标准溶液的配制：
（1）标准储备液配制含咖啡因1000ug/mL的甲醇溶液，备用。
（2）标准系列溶液用上述备用液配制含咖啡因20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL、160ug/mL、320ug/mL的甲醇溶液，备用。
试样市售的可口可乐和百事可乐。
四．实验条件
（1）色谱柱长150mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合物，颗粒度10μm 的固定相
（2）流动相甲醇-水（60：40），流量0.6m/mim
（3）紫外光度检测器测定波长254mm，灵敏度0.08
（4）进样量10μL
五．实验步骤
（1）将配制好的流动相置于超声波清洗仪上脱气15min；
（2）根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，色谱工作六站或记录仪的基线呈平直，即可进样；（3）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，并记录各色谱仪的数据；
（4）分别将约20mL的可口可乐和百事可乐试样置于25mL的容量瓶中，用超声波清洗仪脱气15min；
（5）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，记录各色谱仪的数据；
（6）试验结束后，按要求关好仪器。
六．实验数据处理
（1）记录实验条件
（2）处理色谱数据，将系列对照品溶液与可乐试样的咖啡因色谱峰保留时间及峰面积列于下表中：
（3）绘制咖啡因色谱峰面积-对照品溶液浓度的回归曲线，并计算回归方程和相关系数。
将标样的数据利用EXCEL软件绘图，并计算回归方程，如下：
（4）根据可乐试样中咖啡因色谱峰面积值，计算可乐试样中的咖啡因浓度。
七．思考题
（1）用标准曲线法定量有什么优缺点？
答：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。
标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。
此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。
（2）根据咖啡因的结构特点，咖啡因还可采用其他类型的色谱方法吗？（3）采用咖啡因浓度与色谱峰高作回归曲线，能给出准确的测试结果吗？与本实验的峰面积-浓度回归曲线相比，哪一种方法更好一些？为什么？
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