血凝及血凝抑制实验
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实验二 血凝及血凝抑制实验
实验目的
１血凝试验：滴定病毒的血凝效价(病毒的凝集价)， 采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。
２血凝抑制试验： 应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特 异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒．
３检测实验用鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状 态。
４ 掌握基本操作技术,了解其实用价值 ．
实验原理
流感病毒结构模式图
血凝素（HA） 柱状
刺突：亚型特异性抗原，易变异
血凝素（HA，从H1—H15):呈柱状 功能：
①吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒 侵入细胞
②凝集多种动物的红细胞（血凝试验） ③具抗原性：其抗体能中和病毒---中和抗体
抑制血凝（血凝抑制试验）
血凝试验原理
• 血凝素（hemagglutinin HA）：由病毒基因 编码的糖蛋白刺突。
• 3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。
• 4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡， 室温静止感作15-30min，每5min观察一次结果。
• 5.计算血凝效价，稀释使成为四价备用．
血凝试验结果判定
• 效价判定： 凝集特别显著：“＋＋＋＋” 凝集现象次之：“＋＋＋” 凝集清楚可见：“＋＋” 稍显凝集者：“＋”
• 与病毒吸附和传入宿主细胞有关。 • HA能与人或其它动物多种红细胞表面N－
乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。 • 为病毒的 红细胞凝集反应或血凝反应。
血凝原理
血凝抑制原理
血凝抑制试验原理
病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所 抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸附于 红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝 集的现象，称为血凝抑制．
素
1%鸡红 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
细胞
结果预测 -
--
-
-
++ +++ +++ +++ +++ -
++++
• 血凝效价：呈“＋＋”凝集时的最高稀释 度。此时的稀释度即为1个血凝单位。
结果判定
1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定
血凝反应强度示意图 “4＋” 红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱 缩。 “3＋” 红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。 “2＋” 红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。 “＋” 红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。 “－” 红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。 2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的 终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集 价。
血凝抑制
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排110孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul 生理盐水。 2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入 第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至 第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。
孔号 1 2 3 4 5 6
稀释度 2 4 8
16 32 64
生理盐 25 25 25 25 25 25 血凝素 25 25 25 25 25 25
生理盐水 25 25 25 25 25 25 1%鸡红 25 25 25 25 25 25
细胞 结果预测 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++
7 8 9 10 H 11(+) 12（-)
128 256 、、 、、 弃
A
25 25 25 25 x
25
25 25 25 25 25血 x 凝素
25 25 25 25 25 25
25 25 25 25 25 25
++ +
-
-
++++ _
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 HI 11(+) 12（-)
• 3.在1-12孔内均加入“四价”血凝素25ul，震荡 后，室温静止作用5min。
• 4.在1-12 孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震 荡，室温感作15-30min，每5min观察一次结果。
• 5.观测结果，记录实验数据．
血凝抑制试验结果判定
• 测定孔 RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)
实验材料
器材：U型或V型微量反应板、微量移液器、枪头
试剂：1%鸡红细胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生 理盐水
实验步骤
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排 1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加 25ul生理盐水
2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第 2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至 第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。
稀释度 2 4 8
16 32 64 128 256 、、 、、 弃
Βιβλιοθήκη Baidu
生理盐 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 X
25
待检血 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 x 清
4HA血凝 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
凝集
（-）
• 病毒对照孔：凝集
• RBC对照孔：无自凝
• 血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血
清稀释度。
• 思考题 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反
应？为什么？
2、血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应? 为什么？
3、血凝试验中为什么要加补充液？ 4、为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？ 5、血凝试验和血凝抑制试验中空白对照的意义？
实验目的
１血凝试验：滴定病毒的血凝效价(病毒的凝集价)， 采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。
２血凝抑制试验： 应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特 异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒．
３检测实验用鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状 态。
４ 掌握基本操作技术,了解其实用价值 ．
实验原理
流感病毒结构模式图
血凝素（HA） 柱状
刺突：亚型特异性抗原，易变异
血凝素（HA，从H1—H15):呈柱状 功能：
①吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒 侵入细胞
②凝集多种动物的红细胞（血凝试验） ③具抗原性：其抗体能中和病毒---中和抗体
抑制血凝（血凝抑制试验）
血凝试验原理
• 血凝素（hemagglutinin HA）：由病毒基因 编码的糖蛋白刺突。
• 3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。
• 4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡， 室温静止感作15-30min，每5min观察一次结果。
• 5.计算血凝效价，稀释使成为四价备用．
血凝试验结果判定
• 效价判定： 凝集特别显著：“＋＋＋＋” 凝集现象次之：“＋＋＋” 凝集清楚可见：“＋＋” 稍显凝集者：“＋”
• 与病毒吸附和传入宿主细胞有关。 • HA能与人或其它动物多种红细胞表面N－
乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。 • 为病毒的 红细胞凝集反应或血凝反应。
血凝原理
血凝抑制原理
血凝抑制试验原理
病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所 抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸附于 红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝 集的现象，称为血凝抑制．
素
1%鸡红 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
细胞
结果预测 -
--
-
-
++ +++ +++ +++ +++ -
++++
• 血凝效价：呈“＋＋”凝集时的最高稀释 度。此时的稀释度即为1个血凝单位。
结果判定
1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定
血凝反应强度示意图 “4＋” 红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱 缩。 “3＋” 红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。 “2＋” 红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。 “＋” 红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。 “－” 红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。 2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的 终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集 价。
血凝抑制
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排110孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul 生理盐水。 2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入 第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至 第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。
孔号 1 2 3 4 5 6
稀释度 2 4 8
16 32 64
生理盐 25 25 25 25 25 25 血凝素 25 25 25 25 25 25
生理盐水 25 25 25 25 25 25 1%鸡红 25 25 25 25 25 25
细胞 结果预测 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++
7 8 9 10 H 11(+) 12（-)
128 256 、、 、、 弃
A
25 25 25 25 x
25
25 25 25 25 25血 x 凝素
25 25 25 25 25 25
25 25 25 25 25 25
++ +
-
-
++++ _
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 HI 11(+) 12（-)
• 3.在1-12孔内均加入“四价”血凝素25ul，震荡 后，室温静止作用5min。
• 4.在1-12 孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震 荡，室温感作15-30min，每5min观察一次结果。
• 5.观测结果，记录实验数据．
血凝抑制试验结果判定
• 测定孔 RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)
实验材料
器材：U型或V型微量反应板、微量移液器、枪头
试剂：1%鸡红细胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生 理盐水
实验步骤
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排 1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加 25ul生理盐水
2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第 2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至 第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。
稀释度 2 4 8
16 32 64 128 256 、、 、、 弃
Βιβλιοθήκη Baidu
生理盐 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 X
25
待检血 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 x 清
4HA血凝 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
凝集
（-）
• 病毒对照孔：凝集
• RBC对照孔：无自凝
• 血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血
清稀释度。
• 思考题 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反
应？为什么？
2、血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应? 为什么？
3、血凝试验中为什么要加补充液？ 4、为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？ 5、血凝试验和血凝抑制试验中空白对照的意义？