蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术)

记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入
底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高 ELISA 的灵敏度。
操作过程：
抗原包被→封闭→待检标本→生物素化抗体→洗涤→ 酶标记亲和素→洗涤→加底物显色和 检测 三 免疫荧光技术 利用某些荧光素，如 FITC、R-PE 等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针， 然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧 光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。 （一）细胞膜蛋白分子的检测 原理： 细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或 配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量 每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量 1 直接法：细胞＋荧光素标记的抗 CD 分子的抗体→4ºC 反应 30-60min→荧光显微镜观察 或流式细胞计分析。 2 间接法：细胞＋抗 CD 分子的抗体→4ºC 反应 30-60min 荧光素标记的二抗 4ºC 反应 30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析 悬浮细胞：用 PBS 洗二次后再做染色 贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色 2 Annexin V 检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标) 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V 是一种分子量为 35~36KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。将 Annexin-V 进行 荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞 仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 样本处理和染色方法 1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用 PBS 洗 2 次，加 入 100ul Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光 30min，再 加入 PI（50ug/ml）5ul，避光反应 5min 后，加入 400ul Binding Buffer，立即用 FACScan 进行流式细胞术定量检测（一般不超过 1h）， 同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为 阴性对照。 2 贴壁培养的细胞染色：先用 0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。 3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 （二）细胞内蛋白分子的检测 细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白 TFAR19 的检测等。 操作过程： （1）直接法： 细胞→3％多聚甲醛固定和 渗透化→封闭→荧光素标记的抗体→ 洗涤→荧光显微镜观察或 流式细胞计分析 （2）间接法： 细胞→3％多聚甲醛固定和渗透化→封闭→针对蛋白的特异抗体→洗涤→荧光素标记的二抗 →洗涤 → 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 凋亡相关蛋白 TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因， 前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的 TFAR19 单 克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中 TFAR19 蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期
据实际情况而定 （5）膜的再利用 化学发光后的硝酸纤维素膜用 Stripping Buffer 洗涤后（洗涤 Buffer: 62.5mm pH6.7 的 Tris-HCI 含 2％SDS 和 100mm 的 －2ME ） 用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的 表达情况。一张膜可以重复使用 3－4 次。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交 二、ELISA 1 原理： ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或 抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在 测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通 过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入 酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关， 故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml 水平）， 并且重复性好。 ELISA 常用的酶和底物 辣根过氧化物酶，底物为 OPD, 深桔黄色 ，检测波长 492nm
e: 加入相应抗原
f：加入抗原特异的酶标抗体
g：洗涤
h：显色和检测
（5） ABS-ELISA 技术 （Avidin Biotin system-ELISA
原理
亲和素是一种分子量是 60，000 的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物
素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标
TFAR19 表达水平增高并出现快速核转位现象。同时我们发现，凋亡早期 TFAR19 蛋白的核 转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核 DNA 的片段化，提示 TFAR19 蛋白的核转位是 细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期 TFAR19 的核转位具有普遍 意义，不同细胞凋亡早期均出现 TFAR19 高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的 事件，提供了一种新的技术和指标。 1 悬浮细胞的染色： （1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1×106），PBS 洗 2 次， （2）3%多聚甲醛冰浴 10min，PBS 洗 2 次，1000rpm′10min。 （3）加入 PBS-T 溶液，37°C 孵育 15min，PBS 洗 2 次， （4）加入 200ml 胎牛血清，室温反应 30min。 （5）加入 FITC 标记的 TFAR19 单抗，4°C 反应 30min （6）荧光细胞洗液洗 2 次，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察 TFAR19 在细胞中的定 位。同时用流式细胞计定量检测 TFAR19 蛋白的平均荧光强度。 2：贴壁细胞的原位染色 （1） 贴壁生长的对数期细胞铺在 24 孔或 6 孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长， 待长到 50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。 （2） 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。 （3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ul）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦 激光扫描显微镜观察 TFAR19 在细胞中的定位。 四免疫组织化学技术 原理： 是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应 的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性 巧妙的结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜等）的显像和放大作用，在细 胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并 可在原位显示相应的基因和基因表达产物。 免疫组化染色技术的分类 免疫荧光法（Immunofluorescence technique） 免疫酶法（Immunoperoxidase technique） 免疫金银法（（Immunogold technique） ABC 法（ Avidin-Biotin Complex） 五 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 1 GST 融合蛋白进行 Pulldow 实验
reader 检测
2）抗原固相测抗原
其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在
固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。
方法:
a: 抗原包被 96 孔板； b:封闭;
c: 待测抗原与抗体反应一定时间； d: 加入 96 孔板
e: 洗涤
f：加入酶标二抗
g：洗涤
h：显色和检测
多抗→洗涤→显色→检测
(3)竞争法测抗原
1）抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用
双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。
其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，
结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
方 法 ： 抗 体 包 被 → 封 闭 → 同 时 加 入 待 测 抗 原 和 酶 标 抗 原 → 洗 涤 → 酶 底 物 → 显 色 →ELISA
间接测定 IgM 抗体，必须先将标本用 A 蛋白或抗 IgG 抗处理，以除去 IgG 的干扰。
方法：
a: 抗原包被 96 孔酶标板； b:封闭;
c: 待测血清与 A 蛋白反应一定时间后离心
d: 吸取上清液加入 96 孔酶标板
e: 洗涤
f：加入酶标抗 IgM 的抗体
g：洗涤
h：显色和检测
2）捕获包被法（夹心法）
Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. 3 注意的问题 （1） 蛋白质电泳 常用 SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性 PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine 胶中电泳：用于分子量小于 10kDa 的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离 效果。 （2）转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝 胶大小一致 以适量的转移 Buffer 室温平衡滤纸、凝胶和膜 15－30min，如果是 PVDF 膜，必须先用甲 醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰 染色以确定转移效率膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置 （3）封闭 用 5％脱脂奶粉或 3％BSA （含 0.1％Tween20 TBS 或 PBS 配制） 时间：室温 2h 或 4ºC 过夜 （4）显色或显影 显色 辣根过氧化物酶：底物为 DAB 碱性磷酸酶：底物为 BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含 Tween20 的 TBS 或 PBS 洗涤一次曝光的时间和显影的时间根