第二章生物药物分析与检验常用的方法.

4、反应计时必须准确 反应体系必须预热至规定温度后，加入酶液 ，搅拌均匀，并立即计时；达到反应时间后，要 立即灭除酶活性，终止反应，并记录终止时间。 终止酶反应的方法很多，常用的有：加热使 酶失活；加入酶变性剂；加入酸或碱溶液，使pH 远离最适pH；降低温度。
5、反应量的测定 测底物减少量或产物生成量均可。酶促反应 所用底物的浓度一般都很高，少量底物的消失不 易测准；而产物则是从无到有，变化明显，测定 较为灵敏准确，所以大都测定产物的生成量。 酶活力测定常用的具体方法有化学分析法、 滴定法、比色法、吸收光谱法、荧光法、电化学 法和量气法等。
另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位 是Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩 尔底物转化的酶量。 Kat和U的换算关系： 1 Kat=6×107U， 1U=16.67n Kat
酶的比活力（specific activity）：是指每毫克质量 的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。是用来度 量酶纯度的指标。是生产和酶学研究中经常使用 的基本数据。 比活力越大，酶的纯度越高。 酶在酶制剂中的有效含量可以用每克酶蛋白或每毫 升酶蛋白含有多少酶单位来表示（U/g或U/mL） 固体酶比活力=活力（U）/蛋白（mg） =总活力（U）/总蛋白（mg）
酶分析法必须制备一条酶反应速度相对 于相应的被测物浓度的标准曲线，以便对 未知样品的量进行检验。 在测定未知样品时，所采用的反应、测 定系统和制备标准曲线时所用的系统应完 全相同，而且待测样品的浓度还应控制在 这一曲线范围以内。
2、总变量分析法（又称为平衡点法或终点法）
根据被测物质的性质，选择适宜的分析工具酶 对该物质进行作用，然后再反应完成后，借助理 化方法测出其总变化量，并参考反应的平衡点， 计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法 。该方法仅适用于底物的测定，应用时应考虑工 具酶的用量与反应的平衡点。
第二章 生物药物分析与检验常用的方法
第一节 第二节 第三节 第四节
酶法 电泳法 理化法 生物检定法
第一节 酶法
酶法包括两种类型：酶活力测定法和酶分析法。 酶活力测定法是以酶为分析对象的研究，测定样 品中某种酶的含量或活性。 酶分析法是以酶为分析工具或分析试剂，测定样 品中酶以外的其他物质的含量。 两者检验对象不同 原理和方法相同：以酶专一而高效催化某化学反 应为基础，通过对酶促反应速度的测定或对生 成物等浓度的测定而检验相应物质的含量。
酶的转化数(Kcat)：在单位时间内每一活性中心或 每分子酶所能转换的底物分子数。生产中并不常 用。
（三）酶活力的测定方法
常规测定酶活力的步骤：
1、酶液的稀释 酶制剂是粉剂，要溶解和稀释；液体酶制剂 也要稀释。从测定要求来分析，要求底物浓度要 远大于酶的浓度。初测时，最佳稀释倍数只能通 过试验来确定
2、选择底物浓度 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配置 成一定浓度的底物溶液。要求所用的底物均匀一 致，达到一定的纯度。有的底物溶液要求新鲜配 置，有的则可预先配置后置于冰箱中保存备用。
3、确定酶促反应的最适条件 根据资料或试验结果，确定酶促反应的最适 条件，最适条件包括温度、pH、底物浓度、适宜 的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间 ，不允许抑制剂存在，辅助因子不可缺少。
一、酶活力测定法
（一）酶活力 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学 反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少 量或产物的增加量来表示。 酶反应的速度愈快表示酶活力愈高。
（二）酶的活力单位和比活力 1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是 指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1 分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物 中1微摩尔的有关基团的酶量。 酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位， 通常用酶量来表示。 其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特 定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中 1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位 （IU，又称U）。
二、酶分析法
酶分析法是一种以酶为分析工具（或试剂）的 分析方法。分析对象可以是酶的底物、辅酶活化 剂，甚至酶的抑制剂。 在进行这类分析时，先要根据分析对象选择适 宜的“工具酶”，然后再通过酶反应的测定，并 借助相应的校正曲线来测定他们的浓度或含量。
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1、动力学分析法 原理是通过条件控制，分别使底物、辅酶活 化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度 的主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的 浓度间将具有确定的比例关系，这样测定酶反应 的速度就可求出它们的浓度。 酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件 基本相同，但其所用的酶量必须恒定，被测物以 外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适。
在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度 作用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为 常数，是该带电粒子的物化特征性常数。不同带 电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷 质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后， 由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外 加电场的电压与电泳时间成正比。 利用电泳可以确定胶体微粒的电性质，向阳 极移动的胶粒带负电荷，向阴极移动的胶粒带正 电荷。
• 金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸附阳离 子，带正电荷。 • 非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴 离子，带负电荷。
例如，陶瓷工业中用的粘土，往往带有氧化铁 ，要除去氧化铁，可以把粘土和水一起搅拌成悬 浮液，由于粘土粒子带负电荷，氧化铁粒子带正 电荷，通电后在阳极附近会聚集出很纯净的粘土 。工厂除尘也用到电泳。利用电泳还可以检出被 分离物，在生化和临床诊断方面发挥重要作用。
第二节 电泳法
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反 的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带 电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术 称为电泳技术。 1937 年瑞典学者 A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造 了移动界面电泳仪 ，分离了马血清白蛋白的3种 球蛋白，创建了电泳技术。