体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
药物定量分析样品与分析方法验证
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第四节 生物样品分析方法的 基本要求
二、样品的储存
血浆和血清都必须在采血后即时分离。否则,血凝后 冰冻保存,则因冰冻时引起细胞溶解,而阻碍血浆或 血清的分出,同时因溶血而影响药物浓度变化。
尿样宜立即测定,否则应加入防腐剂或低温冷藏。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析前处理技术
微量药物存在于大量生物介质中,若直接进行 测定,内源性物质可能干扰,药物浓度太低将 会达不到仪器灵敏度要求。因此,生物样品中 的药物必须经过分离、纯化与浓集,必要时还 需对待测组分进行化学改性处理,从而为最后 测定创造良好的条件。
第二节 定量分析方法的特点
二、光谱分析法 (1)紫外分光光度法
特点: 1.灵敏度高,10-4 -10-7g/ml。 2.准确度高,RSD%:2%-5%。 3.仪器价廉物美,操作简便,易于普及。 4.应用广泛。
第二节 定量分析方法的特点
二、光谱分析法 (1)紫外分光光度法
含量测定方法
1.对照品比较法 2.吸收系数法 3.计算分光分度法。 4.比色法
一、概述
原料:不经特殊处理直接测定 原料:经有机破坏后测定 制剂:排除处方中干扰组分
药物
二、不经有机破坏的分析方法
➢(一)直接测定法 ➢1.配位滴定法 ➢2.氧化还原法 ➢(二)经水解后测定法 ➢1.碱水解后测定法 ➢2.酸水解后测定法 ➢(三)经还原分解后测定
二、不经有机破坏的分析方法
➢ (一)直接测定法 ➢ 1.配位滴定法
第四节 体内药物分析简介
定义: 体内药物分析是通过分析手段了 解药物在体内数量与质量的变化, 获得各种药物动力学参数,代谢 的方式和途径等信息。
第四节 体内药物分析简介
体内药物分析第三章生物样品与样品制备
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建立完善的数据记录与审核制度,确保实验数据的真实性和可追溯性。
效果评价指标设定和持续改进方向
效果评价指标
根据实验目的和要求,设定合理的效果评价指标,如方法回收率、精密度、准确度等,对实验结果进 行客观评价。
持续改进方向
针对实验过程中出现的问题和不足,制定改进措施并持续改进,如优化实验条件、改进操作方法、提 高设备性能等,不断提高体内药物分析的质量和效率。同时,关注新技术、新方法的发展和应用,不 断完善和更新质量保证和质量控制体系。
质量控制样品的使用
使用质量控制样品进行方法验证和日常质量监控,确保实验结果的准 确性和可靠性。
质量控制方法选择及实施过程监控
方法学验证
在建立新的体内药物分析方法时,应进行充分的方法学验证,包括专属性、线性、精密度、准确 度、稳定性等方面的考察,确保方法的可行性和准确性。
过程监控
在实验过程中,采用定期抽查、盲样测试等方式对实验过程进行监控,确保实验操作的规范性和 结果的可靠性。
04 生物样品保存、运输和接 收标准操作流程
保存条件及时限设定原则
保存条件
生物样品应在规定的低温条件下保存,以确保样品的稳定性和防止降解。通常,血浆、血清和尿液等样品应在20°C或更低温度下保存,而一些特殊样品可能需要在-70°C或更低温度下保存。
时限设定
生物样品的保存时限应根据其稳定性和分析物的性质来确定。一般来说,长期保存的样品应在采集后尽快处理并 冻存,以避免分析物的降解或转化。同时,应定期对保存样品进行质量评估,以确保其完整性和可用性。
新型生物样品的保 存与运输
对于细胞和基因等新型生物样 品,同样需要在低温条件下保 存和运输。此外,还应避免反 复冻融和长时间存放,以确保 样品的稳定性和可靠性。
体内药物分析样品前处理(final)
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四. 固相萃取法
• 普通C18固相萃取的局限性 去湿效应(De-wetting Effect); 固相萃取材料耐受pH范围较窄(2-7); 对极性化合物保留差; 碱性化合物回收率较低(由于少量未键合的硅羟基所致)。
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四. 固相萃取法
• HLB (Hydrophilic - Lipophilic Balance Copolymer) 材料的优点
平衡/活化: 甲醇/水
上样
清洗1: 2% 甲酸 (锁定目标化合物) 清洗2: 100% 甲醇
(强洗步骤) 洗脱: 2% 氨水在甲醇中
(释放目标化合物)
蒸干/重新溶解 (视具体情况而定)
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k’
四. 固相萃取法
• Oasis MAX
AAcids (HA)
Neutral B
Bases (BH+) 0 2 4 6 8 10 12 14
N
O
pH 0 -14
Hydrophilic monomer
Lipophilic monomer
水可侵润(water wettable); 具有反相保留能力; pH 1-14范围内稳定; 没有裸露硅羟基。
Lipophilic RP Retention
NO
Hydrophilic Retention of Polars
8
一. 样品前处理技术简介
非液态样品 (组 织,器官,干血 点采集样品 DBS)
液态样品 (血 浆,尿液,组织 匀浆液等等)
直接稀释 (所有 物质均被提取)
蛋白沉淀(除蛋白)
液-液萃取(极性类 似的化合物被提取)
固相萃取(同类结构 化合物被提取)
免疫亲和提取(只有 目标化合物被提取)
体内药物分析方法和方法的设计和评价
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为:毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、
毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等
速电泳和毛细管电色谱法。上述这些方法近几
年来在体内药品分析中均得到不一样程度应
用。 体内药物分析方法和方法的设计和评价
第14页
体内药物分析方法和方法的设计和评价
第15页
• 选取何种方法进行体内药品分析为好呢?普通 要依据药品理化性质、结构持征、药品浓度大 小、干扰成份多少、预处理方法、试验目标以 及试验室条件等原因综合起来进行考虑。
体内药物分析方法和方法的设计和评价
第9页
1、HPLC法
• HPLC法在体内药品分析中应用已大大超出其 它分析方法,成为体内药品分析中应用最广泛 技术之一。与GC法相比,它含有以下优点:
• (1)适用范围广,可在室温下进行检测。对于 挥发性低,热稳定性差,分子量大以及离子型和评价
(一)以纯品进行测定
• 取药品或其代谢物纯品适量,按确定方法测 定,求得浓度与测定响应值之间关系,进行线 性范围、最适测定浓度、检测灵敏度、测定最 适 条 件 ( 如 pH 值 、 温 度 、 反 应 时 间 等 ) 等 选 择。
体内药物分析方法和方法的设计和评价
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(二)空白样品测定
• 取空白生物样品,按确定方法进行处理,测定 空白值(或色谱图)。空白值高低或色谱图情况 将影响到方法灵敏度和专属性,应力争将空白 值降低。在色谱分析中应力争降低体内样品中 内源性杂质峰,对无法消除内源性杂质峰应设 法使其从待测物色谱区域内移开。能否取得良 好样品空白试验结果,是决定测定方法实际可 行性主要步骤,必须设法处理。
• 另外,还有一些含抗生素类药品生物样品,它 们可用微生物方法测定,利用抗生素在琼脂培 养基内扩散作用,比较样品与药品标准品二者 对接种试验菌产生抑菌圈大小,借以测定样品 内抗生素药品浓度。
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证ppt课件
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5 唾液
• 唾液中所含成分比较简单,且容 易获得,但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性,实际使用不多,当药物 血浆结合率高的时候,唾液中药 物的浓度极低,很难检测。
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
生物样品的保存:
• 采样后除立即分析外,为防止药物发生变化,应:短 期保存,可 4℃冷藏;长期保存,可-20℃冷冻,不要 反复冻融,必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。
• 全血不易保存,且血细胞中含有 更多的干扰物质,影响测定,故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大,且难以控制 的药物如:环孢霉素A。
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2 血浆
• 测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血 清中的药物浓度,而不是指含有血细胞的 全血中的药物浓度。
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
③加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时,蛋白质以阳离子形
式存在,加入强酸,可与蛋白质阳离子形成不溶性盐 而沉淀。常用的强酸有:10%三氯醋酸等。血清与强 酸的比例为1:0.6混合,高速离心,就可除去蛋白质。 在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
体内药物分析常用生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ样品处理方法和方法学验证
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有:乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时,就可以将90% 以上的蛋白质除去,采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
• 实际应用中,多是取50uL的血浆,加入500uL的有机溶 剂,涡旋离心后,取上清进样;
07体内药物检测与药品检验方法-药物分析
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在杂质可获得的情况下,对于含量 测定,试样中可加入杂质或辅料,考察 测定结果是否受干扰,将含有杂质或降 解产物的试样进行测定,与另一个经验 证了的或药典方法比较结果。
检验方法验证>>
四、检测限 检测限系指试样中被测物能被检测出的
最低量。常用的方法如下。 1.目视法 用已知浓度的被测物,试验出能被可靠
解产物、辅料等)可能存在下,采用的 方法能准确测定出被测物的特性。
检验方法验证>>
1.鉴别反应 应能与可能共存的物质或结构相似化
合物区分。不含被测成分的样品,以及 结构相似或组分中的有关化合物,均应 呈负反应。
检验方法验证>>
2.含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离方法,应附代表性
图谱,以说明专属性。图中应标明诸成 分的位置,色谱法中的分离度应符合要 求。
(1)血浆的制备
将采取的血液置含有抗凝剂(如:肝素、草 酸盐、枸橼酸盐、EDTA、氟化钠等)的试管中, 混合后,以2500~3000rpm离心5~10min使与血 细胞分离,分取淡黄色的上清液即为血浆。
药物分析>>体内药物分析
(2)血清的制备 P?
贮藏采取血样后,应及时分离血浆或血清,并最好立
即进行检测。如不能立即测定时,应根据药物在血样 中的稳定性及时处置止于具塞玻璃试管或EP管中密塞 保存。短期保存时置冰箱(4℃)中,长期保存时要在 冷冻橱(库)(-20℃)中冷冻保存。 。
放射免疫的灵敏度最高,是在生物样品中加 入理化性质、免疫学特性和待测物相同的经放射 性性同位素标记的待测物,将该待测物与特异性 的抗体结合,用测量放射性的方法测量并计算结 合部分与游离部分的比值,从而确定待测物的量。
体内药物分析中的样品预处理技术
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体内药物分析中的样品预处理技术体内药物分析是指体内样品(生物体液、器官或组织)中药物及其代谢产物或内源性生物活性物质的定量分析。
通常药物进入体内后,其化学结构与存在状态就可能发生显著变化。
在体液中,药物的存在形式多样化,除游离型的原料药物或其代谢物,也有原形药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等内源性小分子经共价结合的结合物(或缀合物),还有与蛋白质分子经氢键及其他分子间力结合的结合型药物;而且药物及其代谢物的浓度通常很低、干扰物质多。
因此,在测定时,除少数情况将体液作简单处理后可直接测定外,通常在测定前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理,从而为体内样品中药物的测定提供良好的环境和条件。
常用的样品前处理方法有:去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集及微波萃取和微透析技术等。
一、体内样品种类:体内药物分析采用的体内样品包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。
这些大都具有:①采样量少;②待测物浓度低;③干扰物质多的特点。
二、体内样品预处理的目的:⑴使待测药物游离,以便测定药物或代谢物的总浓度;⑵满足测量方法的要求,纯化浓集样品;⑶保护仪器性能、改善分析环境。
三、常用生物样品预处理技术:⒈有机破坏法:湿法破坏:电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化法干法破坏:高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法氧瓶燃烧法⒉去蛋白质法:溶剂解法(加入与水相混溶的有机溶剂)、加入中性盐、加入强酸、加入含锌盐或铜盐的沉淀剂、超滤法、酶水解法、加热法⒊分离、纯化和浓集法:液﹣液萃取法、固相萃取法⒋缀水物的水解法:酸水解法、酶水解法⒌化学衍生化发:硅烷化、酰化、烷基化、紫外衍生化、荧光衍生化、点化学衍生化、生成非对映异构体衍生化发四、新兴生物样品预处理技术:⒈微波消解⒉自动化固相萃取⒊固相微萃取⒋液相微萃取⒌微透析技术⒍超临界流体萃取⒎分子印迹固相萃取这里就固相微萃取技术和超临界流体萃取技术进行简单说明:⑴固相微萃取固相微萃取( Solid phase micro2-extraction,SPME) 是80年代末发展起来的样品预处理方法, 其装置简单, 操作方便, 已实现自动控制, 适用于现场分析。
第4章体内药物分析方法的建立与验证 体内药物分析课件,药物分析研究生复试用.重点已标红
![第4章体内药物分析方法的建立与验证 体内药物分析课件,药物分析研究生复试用.重点已标红](https://img.taocdn.com/s3/m/7f4d621c376baf1ffc4fada3.png)
二、分析方法的建立
分析方法建立之前
需查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程,使所拟定
的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
Hale Waihona Puke 文献查阅:摘要——medline,CA;药学文摘,分析文摘。
全文——各种杂志 移植或改进文献方法
建立新方法。
二、分析方法的建立
初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件
第四章 体内药物分析方法 的建立与验证
2012-4
本章内容提要
分析方法的设计依据
分析方法建立的一般步骤 分析方法验证的内容与要求 分析方法验证的相关国际规范 体内药物分析应用示例
第一节 分析方法的设计依据
待测药物与生物介质 体内分析的目的 实验室的设备条件
待测药物与生物介质
同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品
分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的 ——为便于讨论而分别叙述
分析方法的建立步骤
第一步:检测条件的筛选 第二步:分离条件的筛选
1 检测条件的筛选
取被测组分(药物或代谢产物)、内标物 质的标准物质(对照品、标准品或符合标 准的原料药)进行试验。 确定最佳检测条件和检测灵敏度(响应值)
二、分析测定的目的与要求
体内药物分析的目的影响分析方法的应用
药代动力学:研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 不必强调方法的简便、快速; 大多采用色谱及其脱线或在线联用技术,如HPLC、LC-MS
临床治疗药物监测: 测定有效治疗浓度范围内药物浓度 方法尽量简便、易行;适用于长期、批量样品的测定
体内药物分析
![体内药物分析](https://img.taocdn.com/s3/m/9f1321debb0d4a7302768e9951e79b8969026874.png)
体内药物分析第二章生物样品与样品制备1.体内药分的对象:人体和动物体液、组织、器官、排泄物 2.体内药物分析的特点:样品量少,不易重新获得;样品复杂,干扰杂质多;供临床用药监护的检测分析方法要求简便、快速、准确,以便迅速为临床提供设计合理的用药方案及中毒解救措施;实验室拥有多种仪器设备,可进行多项分析工作;工作量大,测定数据的处理和阐明有时不太容易。
需相关学科参与。
3.体内药物分析样品的种类:最常用且易获得的分析样品有:血样、尿样、唾液和粪便。
特殊情况下:乳汁、泪液、脊髓液、胆汁、羊水、各种组织4.血清:血清是由血液中纤维蛋白原等的影响引起血液凝结而析出的澄清黄色液体,约为全血的30%?50%5.尿液:尿液的主要成分:水、含氮化合物、盐类;体内药物清除主要通过尿液排出,药物以其原型或代谢物及其缀合物等形式排出;尿药测定主要用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、药物代谢率的研究,并可推断患者是否按医嘱用药。
6.生物样品分析的前处理:是指测定生物样品中的药物及其代谢物时,对样品进行分离、纯化、浓集,必要时对待测组分进行衍生化,为测定创造良好的条件。
7.为何进行前处理?1)药物进入体内除原药外还有多种形式存在2)生物样品的介质组成比较复杂,尤其蛋白质严重影响分离效果,必须进行前处理3)除去介质中含有的大量内源性物质等杂质,提取出低浓度的被测药物,同时浓集药物或代谢物的浓度,使其在所用分析技术的检测范围内。
8.生物样品处理方法选择的一般原则:待测药物的理化性质;待测药物测定的目的与浓度范围。
9.去除蛋白质的方法:加与水相混溶的有机溶剂;加入中性盐;加入强酸;加入含锌盐及铜盐的沉淀剂;酶解法。
10.生物样品的分析由两步组成:样品的前处理(分离、纯化与浓集)和对提取物的仪器分析;提取法是应用最多的分离、纯化方法;提取的目的:从大量共存物中分离出所需要的微量组分药物及其代谢物,并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集,以供测定;提取法分为液 -液提取法和液 - 固提取法。
体内药物分析方法(精选)
![体内药物分析方法(精选)](https://img.taocdn.com/s3/m/049ed363abea998fcc22bcd126fff705cc175cd2.png)
体内药物分析方法(精选)体内药物分析方法(精选)随着现代医学的发展,药物在疾病治疗中起到了至关重要的作用。
对于新药物的研发、药物代谢的了解以及用药的个体化,需要使用合适的体内药物分析方法。
本文将介绍几种常用的体内药物分析方法。
一、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)液相色谱-质谱联用法(LC-MS)是一种将液相色谱(LC)和质谱技术(MS)结合起来的分析方法。
它通过将待测样品进行分离,利用质谱技术对分离后的成分进行快速、准确的鉴定和定量。
LC-MS在药物代谢动力学研究、药物相互作用分析、药物残留检测、药物中间体的筛选等方面具有广泛的应用。
二、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)气相色谱-质谱联用法(GC-MS)是一种将气相色谱(GC)和质谱技术(MS)结合起来的分析方法。
它通过将待测样品在高温条件下蒸发,然后在气相色谱柱上进行分离,最终通过质谱技术对分离后的物质进行鉴定和定量。
GC-MS在药物代谢研究、毒物学研究、药物滥用检测以及环境污染物分析等方面具有重要的应用价值。
三、原子吸收光谱法(AAS)原子吸收光谱法(AAS)是一种通过测量原子在特定波长的光束中吸收光的强度来定量分析样品中金属元素的方法。
AAS广泛用于测定药物中的微量金属元素。
例如,铁、锰、铜、锌等微量金属元素在生物体内被广泛应用。
AAS具有灵敏度高、准确性好等优点,成为体内药物分析中的重要技术手段。
四、高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法(HPLC)是一种将液相色谱技术与高压技术结合起来的分析方法。
它通过将待测样品在高压下通过色谱柱进行分离,然后通过检测器对分离后的组分进行定性和定量。
HPLC广泛应用于药物代谢、药物溶出度的测定、药物杂质的分析等方面。
五、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)是一种将电感耦合等离子体技术与质谱技术结合起来的分析方法。
它利用高温等离子体对待测样品中的元素进行电离和激发,然后通过质谱技术进行分析。
体内药物分析方法验证主要有哪些
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体内药物分析方法验证主要有哪些体内药物分析的方法有很多,归纳起来主要有以下5类:
1、色谱分析法:
体内药物分析中,色谱技术(Chromatography)一直是研究体内药物及其代谢物最强有力的手段,其在体内药物分析中的应用始于上世纪八十年代。
2、联用分析法:
目前使用较广泛的为色谱联用分析法和色谱与核磁共振联用分析法。
3、免疫分析法:
免疫分析法(Immunoassay,IA)的原理是利用抗原-抗体的特异反应来测定体内药物的含量。
它将分析方法与免疫原理相结合,进行超微量分析,具有灵敏度高、选择性强、操作简便、快速用量少、样品一般不需进行预处理等优点。
4、光谱分析法:
光谱分析法(SpectroscopicAnalysis)包括比色法(COL)、紫外分光光度法(UV)、荧光分光光度法(FLUOR)和原子吸收分光光度法。
5、电化学分析法:
电化学分析法(ElectrochemicalAnalysis)是一类基于电池内发生电化学反应而建立起来的方法。
测定时,通过选择适当的电极组成化学电池,以测定电压、电流、电阻、电量等电信号强度变化来对
药物进行定性和定量分析。
该类方法的特点是仪器设备简单、操作方便,易于实现测试的连续化和自动化。
生物样品方法学验证及数据处理
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摘要目的:建立体内含量测定方法学,规范数据处理。
适用范围:体内实验,酶实验等。
1仪器试剂1.1仪器涡旋仪,20ul、200ul、1000ul移液枪,高速离心机,氮吹仪1.2试剂甲醇、乙腈(色谱纯)2操作规程2.1溶液配制2.1.1内标溶液配置(假设需加入20ul内标液的浓度为50ug/ml)将储备液浓度稀释到40ug/ml2.1.2标准曲线浓度配置假设血药最大浓度为30ug/ml,则设标曲血药最大浓度为60ug/ml血药浓度设定点为:60,30,12,6,2.4,1.2,0.48,0.24ug/ml10ul药物浓度为:600,300,120,60,24,12,4.8,2.4ug/ml(若吸收值比较大,继续逐级稀释,最低点测不到可减少浓度点)对应的序号为:1,2,3,4,5,6,7,8(稀释规律为1稀释两倍为2,1稀释5倍为3,2稀释5倍为4,3稀释5倍为6,一次类推);在设定QC浓度时通常2号定为高浓度,中浓度一般选择标准曲线中间浓度可以选择4号或者5号,低浓度通常选择7号,标准曲线最低点即8号为最低定量限浓度(LLOQ)2.1.3加入的20ul药液配置取内标溶液(40ug/ml)X ul,再取同体积的配置的10ul药物浓度混合后即得。
2.2实验步骤2.2.1所需要处理的样品及具体细则:(1)处理标准曲线样品三套(随行空白样品)编号:1-1,1-2,1-3,1-4,1-5,1-6,1-7,1-8;1-kb2-1,2-2,2-3,2-4,2-5,2-6,2-7,2-8;2-kb3-1,3-2,3-3,3-4,3-5,3-6,3-7,3-8;3-kb操作:EP管加20ul药液(内标+药物),再加入空白血浆,沉淀蛋白,取上清液氮气吹干,复溶,进样(开始时进一套标曲,中间进一套标曲,最后进一套标曲)。
(2)处理QC样品(高、中、低)、LLOQ样品,每个浓度5份/天,连续处理三天编号:1高0-1,1高0-2,1高0-3,1高0-4,1高0-5;1中0-1,1中0-2,1中0-3,1中0-4,1中0-5;1低0-1,1低0-2,1低0-3,1低0-4,1低0-5;LL-1,LL-2,LL-3,LL-4,LL-5(最低定量限).2高0-1,2高0-2,2高0-3,2高0-4,2高0-5;2中0-1,2中0-2,2中0-3,2中0-4,2中0-5;2低0-1,2低0-2,2低0-3;2低0-4,2低0-5.3高0-1,3高0-2,3高0-3,3高0-4,3高0-5;3中0-1,3中0-2,3中0-3,3中0-4,3中0-5;3低0-1,3低0-2,3低0-3,3低0-4,3低0-5.操作:EP管加20ul药液(内标+药物),再加入空白血浆,沉淀蛋白,取上清液氮气吹干,复溶,进样(每天进一批QC样品连续进三天)。
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
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体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证1.血浆血浆样品处理方法主要包括离心、超滤、蛋白沉淀和固相萃取。
首先,通过离心将血清和细胞分离,并将上清液收集。
然后,使用超滤技术去除高分子物质,如蛋白质,以得到更纯净的血浆样品。
接下来,可以使用蛋白沉淀方法去除血浆中的蛋白质,以便进一步分析非蛋白质药物。
最后,固相萃取是常用的药物浓度测定方法,可以通过固相材料吸附目标药物,然后用洗脱液洗脱和浓缩样品,最后定量分析。
2.尿液尿液样品处理方法常采用固相萃取、pH调节、加入稳定剂等技术。
固相萃取可以去除尿液中的杂质,并将药物萃取到固相材料上,然后用洗脱剂将药物洗脱出来。
pH调节可以使药物离子化或去离子化,以提高其固相萃取的效率。
此外,加入稳定剂可以保持样品的稳定性,防止药物分解或降解。
3.组织和细胞组织和细胞样品处理方法包括离心、组织切割、细胞溶解和蛋白沉淀等技术。
首先,通过离心将组织或细胞分离,并收集上清液。
然后,使用组织切割技术将组织样品切成适当的大小。
对于细胞样品,可以使用细胞溶解剂将细胞完全裂解。
最后,蛋白沉淀可以去除样品中的蛋白质,以便进一步分析非蛋白质药物。
方法学验证是为了确保分析方法的准确性和可靠性而进行的步骤和操作流程的验证。
主要包括以下几个方面:1.线性范围验证:验证方法在一定浓度范围内,药物浓度与测定结果之间的关系是否呈线性。
2.灵敏度验证:验证方法的最低检测限、最低定量限和测定范围等指标,以评估方法对药物浓度的敏感度。
3.精密度和准确度验证:通过重复测定和与参考方法比较等方法验证方法的重复性和准确性。
4.选择性验证:验证方法对样品中其他可能存在的干扰物的选择性,以保证药物的测定不受干扰。
5.稳定性验证:验证样品在不同温度、时间、pH条件下的稳定性,以评估样品的保存期限和条件。
综上所述,体内药物分析常用的生物样品处理方法包括血浆的离心、超滤、蛋白沉淀和固相萃取,尿液的固相萃取、pH调节和加入稳定剂,组织和细胞的离心、组织切割、细胞溶解和蛋白沉淀等。
8.5体内方法评价
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空白血浆
系列标准含 药血浆样品
不同浓度的待测药 物的系列标准溶液
标(二准) 标曲准线曲与线范与围定量范围
线性范围应能覆盖全部待测的生物样品浓度范围,不能使 用定量范围外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度
标(二准) 标曲准线曲与线范与围定量范围
标准曲线的绘制: 以待测药物的检测响应(如色谱峰面积) 或与内标物质(内标法)
最低浓度点的偏差在±20%以内
曲线合格
其余浓度点的偏差在±15%以内
定量下限(LLOQ)
是标准曲线上的最低浓度点,表示方法的灵敏度 LLOQ应能满足测定3~5个消除半衰期时生物样
品中的药物浓度,或Cmax的1/20~1/10 测定法:取同一生物介质,制备至少5个独立的标
准样品 准确度应在标示浓度的80%~120%范围内,相对标
与常规分析方法的验证相比,体内药物分析验证的 技术指标基本相同,但具有特殊性。
参体考内资药料物分析方法验证--指导文件
1.中国人民共和国药典2015年版第四部指导原则:
生物样品定量分析方法验证 2. FDA Guidance for Industry
– Bioanalytical method validation, 2013 3. ICH Guidance for industry
代谢产物对待测物、内标物的干扰 配伍用药的干扰 进一步验证方法的可行性
实体例:内H药PLC物法分测定析人方血浆法中建泮立托拉唑
空白血浆
空白血浆 +泮托拉唑(1) +内标(2)
服药后血浆样品
体二内、药分物析分方析法方的法验验证证
方法学验证(validation):保证所建立的分析方 法的可行性与可靠性
生物体内药物分析方法的选择及应用
![生物体内药物分析方法的选择及应用](https://img.taocdn.com/s3/m/2eaca49e6f1aff00bfd51e06.png)
2.2 体内药物分析方法设计与建立的一般步骤
总的原则:
根据被测药物的性质 药物浓度的大致范围(经验估计) 仪器设备条件 对药物和研究目的的理解程度
灵敏 专一 简捷 可行
初步分析方法的预试
优化
确认
以药物进行测定 空白生物介质(杂质)
空白生物介质 + 药物
给药后的生物样品 (有无药物?产物?)
考虑内标的选择
2. 体内药物分析方法设计与建立
2.1 体内药物分析方法设计的主要依据
2.1.1 明确分析方法设计的目的要求
a. 临床药物监护:
简便、快速、批量测定
b.药代动力学研究:
是否要求原形药物与代谢物同时测定 注意整个浓度变化的范围 样品量多, 方法尽可能简便
c. 配合新药设计合成、药理、毒理学的研究:
回收率:
分析过程的提取效率,以样品提取和处理过程前后分析 物含量百分比表示。
选择性:
分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共 存组分可能包括代谢物、杂质、分解产物、介质组分等
定量范围:
包括定量上限(ULOQ)和定量下限(LLOQ)的浓度范 围,在此范围内采用浓度-响应关系能进行可靠的、可重 复的定量,其准确度和精密度可以接受。
定量分析 定性分析(半定量)
Distribution Metabolism
Absorption Excretion
生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程、 获得药代参数的重要手段之一。
1.2 方法学类型及特点:
体内药物分析方法大致可归为主要的五类:
1. 光谱分析法 2. 色谱法 3. 毛细管电泳法 4. 免疫分析法 5. 同位素法 (……)
Accuracy of the method, defined by the percent relative error ( %RE = (standard observed concentration-nominal concentration) ÷ ( nominal concentration )×100)
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
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萃取小柱一次性使用,防止交叉污染!
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固相萃取操作一般有五步:
活化——甲醇/乙腈 润湿小柱,活化填料; 平衡——水或适当缓冲液冲洗平衡小柱; 上样——将样品转移上柱,抽去废液; 淋洗——水或缓冲液最大程度洗去干扰物; 洗脱——用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
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实际应用中,多是取50uL的血浆,加入500uL的有机溶 剂,涡旋离心后,取上清进样;
若沉淀后,信号相应不好,可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时,加入酸或碱,调节pH值,可能会对结果影 响很大;
常用的酸碱有:盐酸,甲酸,乙酸,氨水等。
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优点:操作简单,为方法开发中最先考虑使用的。
尿液中药物浓度较高,但尿液浓度受尿量的影响,通常变 化较大,应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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5 唾液
唾液中所含成分比较简单,且容 易获得,但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性,实际使用不多,当药物 血浆结合率高的时候,唾液中药 物的浓度极低,很难检测。
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HPLC中化学衍生化法,包括柱前衍生化和柱后衍生化两 种方法。
柱前衍生化分析前尽可能将药物进行提取分离后再衍生 化,防止其他含有相同的功能基团的杂质也被衍生化, 影响分离。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的 ,所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物。
HPLC法常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹磺酰氯、荧胺 等。
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1.沉淀蛋白
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂,可使蛋白质的分子内及分子间
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实际应用中,多是取50uL的血浆,加入500uL的有机溶 剂,涡旋离心后,取上清进样;
若沉淀后,信号相应不好,可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时,加入酸或碱,调节pH值,可能会对结果影 响很大;
常用的酸碱有:盐酸,甲酸,乙酸,氨水等。
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优点:操作简单,为方法开发中最先考虑使用的。
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60%以上精力和花费用在样品前处理上
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二、生物样品的种类
生物样品包括各种体液和组织,但实际上最常用的是 比较容易得到的血液(全血、血浆、血清)、尿液、粪便、 唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。
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1 全血
全血不易保存,且血细胞中含有 更多的干扰物质,影响测定,故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大,且难以控制 的药物如:环孢霉素A。
质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用
的沉淀剂有:CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血 清与沉淀剂的比例为1:2混合,高速离心、分离后定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时,常需用 酶解法。
在测定尿中的药物浓度时,由于尿中药物主要以缀合 物的形式排除,较原型药物具有较大的极性,不易被 有机溶剂提取,常用酶水解的方法。
体内药物分析的样品处理 和方法学验证
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1.为什么要对生物样品进行处理? 2.有哪些生物样品? 3.有哪些样品处理方法?各自的特点。 4.如何对分析方法进行验证? 5.有哪些参考标准?
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2
一、处理的目的
生物样品进行前处理的目的在于:
1.药物进入体内后,经吸收、分布、代谢,然后排出体 外。在体液、组织和排泄物中除了游离型(原型)药物 之外,还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、 以及药物或其代谢物与内源性物质,如葡萄糖醛酸、硫 酸形成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯缀合物等多种形式存在, 需要分离后测定药物及代谢物。
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2 血浆
测定血中药物浓度通常是指测定血浆或 血清中的药物浓度,而不是指含有血细 胞的全血中的药物浓度。
将采取的血液置含有抗凝剂(如:肝素、 EDTA)的试管中,混合后,3000至4000 r/min离心,分离血细胞,上清液即为血 浆。
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血浆中含有的物质种类和比例
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3 血清
血清是在采血后不加任何抗凝剂,于室温下静置1530 min,待其自然凝结后,离心,分离出上清液。血清 颜色较血浆更浅,成分较血浆少了大部分的纤维蛋白, 更易进行处理,且血浆及血清中的药物浓度测定值通常 是相同的。
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③加入强酸
当pH低于蛋白质的等电点时,蛋白质以阳离子形 式存在,加入强酸,可与蛋白质阳离子形成不溶性盐 而沉淀。常用的强酸有:10%三氯醋酸等。血清与强酸 的比例为1:0.6混合,高速离心,就可除去蛋白质。 在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
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④加入锌盐或铜盐沉淀剂
当pH高于蛋白质的等电点时,金属阳离子与蛋白
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1.沉淀蛋白
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂,可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有:乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时,就可以将90% 以上的蛋白质除去,采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
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生物样品的保存:
采样后除立即分析外,为防止药物发生变化,应:短 期保存,可 4℃冷藏;长期保存,可-20℃冷冻,不 要反复冻融,必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。
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三、常用的处理方法
主要应考虑生物样品的种类,被测药物的性质和 测定方法三个方面的问题。
1.沉淀蛋白 PPT 2.液液萃取 LLE 3.固相萃取 SPE
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4 尿液
尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后,为了 保存,常会加入防腐剂。
体内药物清除主要是通过尿液排出,药物可以原型或代谢 物及其缀合物等形式排出。
尿液中药物浓度较高,但尿液浓度受尿量的影响,通常变 化较大,应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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5 唾液
唾液中所含成分比较简单,且容 易获得,但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性,实际使用不多,当药物 血浆结合率高的时候,唾液中药 物的浓度极低,很难检测。
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其他的一些去除蛋白质的方法:
超速离心法 平衡透析法 最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的
血浆蛋白结合率。
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2.液液萃取法 LLE
药物在体内吸收,需经跨膜转运,所以多数药物 具有一定的脂溶性,而生物样品中大多数内源性杂质 是强极性的水溶性物质,所以可以根据药物分子与基 质之间极性的差异,使用适当的有机溶剂提取药物, 有机溶剂提取可一次除去大部分杂质。
缺点:只使用于样品中浓度较高的药物测定;且处理 后,样品中仍然会存在很多干扰物质,对结果产生干 扰;残余的杂质会堵塞色谱柱,污染仪器。
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②加入中性盐
中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来,从而使蛋 白质脱水而沉淀。常用的中性盐:饱和硫酸胺、硫酸钠、 镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂提 取法常并用,药物的回收率较高。
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有机溶剂应选择稳定,易挥发,低毒性,不与水相混溶的 溶剂。常用的有机溶剂有:乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔 丁基甲醚和氯仿等。
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一般认为,当药物在体内达到稳定状态时,血浆中药 物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关,即血浆中的药物浓 度反映了药物在体内(靶器官)的状况,因而血浆浓度可作 为作用部位药物浓度的可靠指标。
血浆和血清可以稳定的冰冻保存,一般储存在-20℃的 条件,长期保存时可以保存在-80℃的条件下,是生物样品 检测中最常用的样本。
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2.生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高 分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物, 也含有Na+、K+、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响 测定的准确性和灵敏度,同时会污染仪器。因此,为了保 护仪器,提高测定的灵敏度,保证检测结果的准确性和可 靠性,必须对样品进行前处理。