核酸提取纯化常见问题解答
核酸抽提的一些基础知识解答
核酸抽提的基础近期撰写了一个对于核酸抽提的基础现状的底稿；没有去找参照书润饰，所以会有点纷乱。
第一申明的是：这篇东西只为有必定核酸抽提基础知识的人准备，同时也将会实时改正。
那些分子生物学的过客，最好不要看本文；一是我的思想有点跳跃，二则是没有必需糟践自己的时间。
写这篇东西的此外一个原由是，我向来在思虑怎样简化经典的无介质的核酸抽提程序。
最经典的是裂解一步，去蛋白质一步，核酸积淀一步； DNAzol 将这三步并成了一步，按道理已经简化到了极致。
事实是， DNAzol 并无被大家认同，其原由大体仍是质量不太靠谱吧。
此刻也有使用 Proteinase K 消化后直接积淀核酸的方法，三步简化成了两步，可我总感觉醇的积淀不行能完全去除Proteinase K。
明年大体还没有生物学的诺贝尔奖会花落中国的，那么先求得一个核酸抽提最简单的非介质方法世界当先怎样？一笑！也必定。
1、核酸抽提原理简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。
裂解是使样品中的核酸游离在裂解系统中的过程，纯化则是使核酸与裂解系统中的其余成分，如蛋白质、盐及其余杂质完全分其他过程。
经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDS、Triton X-100 、NP-40、Tween 20 等）和盐（如 Tris 、EDTA 、 NaCl 等）。
盐的作用，除了供给一个适合的裂解环境（如 Tris），还包含克制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的损坏（如EDTA ）、保持核酸构造的稳固（如 NaCl）等。
去污剂则是经过使蛋白质变性，损坏膜构造及解开与核酸相连结的蛋白质，进而实现核酸游离在裂解系统中。
裂解系统中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促使核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后边的纯化操作以及获取更纯的核酸。
也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如 GIT 、GuHCl 等）裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是 DNA 抽提的主流。
DNA提取常见问题
DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子对策1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）问题二：DNA降解。
1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融对策1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题三：DNA提取量少。
1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失对策1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌——是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。
目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。
与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统所具有的优越性：①经过长期研究，人们已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解；②大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；③实验已经证明，许多克隆的真核基因，例如抑制生长素基因和胰岛素基因等，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；④大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。
核酸的纯化
核酸的纯化核酸的纯化在分子克隆的所有操作中，最基本的操作也许要算核酸的纯化了。
其关键步骤是去除蛋白质，通常只要用酚：氯仿抽提核酸的水溶液即可。
每当在进行下一步操作之前需要把这一步克隆操作所用的酶灭活并去除时，都可采用这种抽提的方法。
然而如果要从各种复杂分子的混合物如细胞裂解液中纯化核酸，则需一些附加办法。
在这些情况下，通常是在有机溶剂抽提之前先用某些蛋白水解酶去掉大部分蛋白质，这些广谱的蛋白水解酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K .用酚：氯仿抽提从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法是先用酚：氯仿(可含有0.1%的8-羟基喹啉)抽提后再用氯仿抽提。
这个方法的好处是使用两种不同有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。
此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制RNA酶的活性，酚还能溶解带有长poly(A)的RNA分子(Brawerman et al.1972)。
用酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合液抽提能够使这两个问题同时得以解决。
随后用氯仿抽提则可去除残留在核酸制品中痕量的酚。
通过乙醚抽提去除酚已广泛沿用多年，看来在目前的常规操作中已不必要或者不推荐使用。
(1)将样品转移到一只聚丙烯离心管中，加入等体积的酚：氯仿。
如果酚未被充分平衡至pH值为7.8-8.0，核酸将趋于分配到有机相。
(2)混合管中的内容物使之成为乳浊液。
(3)室温下用离心管可承受最大转速的80%的速度离心1min，若有机相与和水相不能充分分开，延长时间重新离心。
一般情况下水相处于上层，然而当水相中盐浓度(>0.5mol/L)或蔗糖浓度(>10%)过高而密度较大时，水相可能会在下层。
由于在平衡酚时加了8-羟基喹啉(见附录1)，其黄颜色可使有机相易于辨别。
(4)用移液管把水相转移到另一离心管中，体积较小(<200ul)时可用带一次性吸头的自动移液器操作。
弃去两相间的界面层和有机相。
为了获得最高的收率，可按下法对有机相和介面层进行“回提”：按上述方法第一次移出水相后，在剩余的有机相和介面层中加入等体积TE(PH7.8)，充分混匀，按第3步离心分离两相，合并两次得到的水相，继续按第5步操作。
核酸的纯化主要方法
分离纯化核酸时的注意事项：防止物理因素的降解：1.尽量简化操作步骤，缩短提取时间，以减少变性机会。
2.防止热变性，避免高温。
一般0-4℃。
3.防止机械剪切作用动作轻缓；搅拌温和；加山梨醇等增加渗透压。
防止化学因素的降解：1.避免强酸强碱作用，抽提液pH要保持在4-10之间。
2.保持提取液一定的离子强度，以调节核酸的溶解度和保持二级结构的稳定性。
防止核酸酶的降解防止DNA酶的降解：通常加入酶的抑制剂、蛋白质的变性剂和去垢剂来实现。
1.加入金属离子螯合剂抑制DNA酶2.去垢剂及某些RNase抑制剂，对DNA酶也有一定抑制作用。
防止RNA酶的降解：RNase很难抑制，且无处不在，汗液、唾液中均有。
很耐热，80℃处理15分钟不能灭活。
操作注意事项：1.带一次性手套、口罩；2.器皿试剂高压灭菌或用DEPC（乙二基焦炭酸）处理。
但含有Tris的试剂不宜用，因DEPC可与胺类迅速发生化学反应。
3.尽早除去蛋白质（含RNase）,并加抑制剂。
常用的抑制RNase活性的方法有：1.核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin,人胎盘中分离的一种蛋白）优点：效果好，不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
使用注意事项：（1）置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DDT）的50%甘油中，-20℃储存。
（2）最大活性的发挥要求有巯基试剂。
（3）冻融数次后应弃之不用。
（4）在变性裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步骤中不宜使用，在其后RNA纯化步骤中应用。
用酚抽提可除去蛋白质抑制剂，故纯化过程中应补加。
2．糖核苷复合物（vanadyl-ribinucleaside complex）由氧钒（IV）离子和4种核糖中的任意一种形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNase结合并几乎能百分百地抑制RNA酶的活性。
缺点：强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译。
可用0.1%羟基喹啉的苯酚（用0.01mol/L E(pH>7.8)平衡）多次抽提除去。
核酸纯化试剂使用方法及注意事项
基因检测之核酸纯化试剂使用方法及注意事项核酸纯化试剂广泛应用于PCR反应、DNA酶切反应、DNA修复反应、DNA末端加A反应及DNA连接反应产物的DNA片段分离和纯化，其使用方法因不同厂家而不同，不过大家追求的目的是一样的，就是使用方法简单，纯化效率高，小片段DNA去除率高，文库回收率高，价格合适，下面以一氪生物技术的核酸纯化试剂盒为例举例说明，其使用方法简单，价格适中，性能也非常不错，指标如下：1纯化效率≥80%；2小片段DNA（150bp 以下）去除率≥96%，大片段DNA（200bp以上）回收率70%，其使用方法如下：一氪核酸纯化试剂性能指标与别家对比一氪核酸纯化试剂盒主要成分步骤一：使用无水乙醇与纯化水配制70%乙醇备用。
步骤二：从2-8℃冰箱中取出磁珠悬浮液，在室温条件下震荡混匀，平衡30min。
图1：一氪标准DNA纯化参考体系（磁珠用量为1.8倍反应液体积）步骤三：将充分震荡混匀平衡后的磁珠加入待纯化酶反应或PCR反应产物溶液中。
磁珠加入体积分别参考图1和图2，若待纯化产物体积不足，可用纯化水或10mM Tris-HCl（pH8.0）补充至相应体积。
图2：一氪标准DNA纯化参考体系（磁珠用量为0.9倍反应液体积）步骤四：用移液器反复吹打10次，将磁珠悬浮液和PCR产物或者酶反应物充分混匀，室温条件下静置5min。
步骤五：将反应板放置在磁力架上，静置2min，待溶液澄清后将上清吸走，转入废液桶内。
步骤六：向反应板中加入200μL新鲜配置的70%的乙醇，室温静置30s。
静置结束后将乙醇吸走，转入废液桶内。
操作环节不可将反应板从磁力分离架上拿下或将磁珠吹散。
步骤七：重复步骤六。
步骤八：保持反应板置于磁力架上状态，室温开盖晾干2min以去除残存的乙醇。
步骤九：将反应板从磁力架上取下来，加入50μL洗脱液，移液器反复吹打10次混匀，室温静置3min。
洗脱液加入量根据实际需要而定，但应不少于5μL。
磁珠法核酸提取过程中的6种常见误区
磁珠法核酸提取过程中的6种常见误区磁珠法是一种常用的核酸提取方法，具有高效、快速和可靠的特点。
然而，在进行磁珠法核酸提取的过程中，也存在一些常见的误区。
本文旨在介绍这些误区，并提供相关指导，帮助读者避免在磁珠法核酸提取中犯错。
误区一：选择不合适的样本处理方法样本的处理对于磁珠法核酸提取非常重要。
若样本处理不当，可能导致提取效果不佳。
因此，在进行磁珠法核酸提取前，应根据样本的类型和特点选择合适的处理方法，如细胞溶解、组织破碎等。
同时，应注意样本处理过程中的温度、时间和强度等因素，确保样本得到充分溶解和破碎。
误区二：未严格控制提取试剂的使用量磁珠法核酸提取试剂盒通常提供了详细的使用说明，包括试剂的使用量以及样本和试剂之间的比例关系。
然而，有些使用者在操作过程中未严格按照说明进行试剂的使用，导致提取效果不佳。
因此，在使用磁珠法核酸提取试剂盒时，务必仔细阅读使用说明，并根据说明操作，严格控制试剂的使用量，避免浪费或不足。
误区三：未注意试剂的保存方式和有效期磁珠法核酸提取试剂的保存方式和有效期对于提取结果有直接影响。
有些使用者在使用过期试剂或未妥善保存试剂的情况下进行核酸提取，导致提取效果不佳。
因此，应及时查看试剂的有效期，并妥善保存试剂，避免存放在不适当的温度或湿度下。
误区四：未进行足够的洗涤步骤洗涤步骤是磁珠法核酸提取过程中的重要环节，能够去除杂质，提高纯化效果。
然而，有些使用者在洗涤步骤中未进行足够的洗涤次数，导致提取产物中残留有污染物。
因此，在进行磁珠法核酸提取时，应严格按照说明进行洗涤步骤，进行足够的洗涤次数，确保提取产物的纯净度。
误区五：未注意磁珠的悬浮和离心条件磁珠的悬浮和离心条件对于核酸提取效果具有重要影响。
有些使用者在磁珠的悬浮和离心过程中没有注意到悬浮的均匀性和离心的速度与时间，导致磁珠沉降不均匀或未能充分离心。
因此，在进行磁珠法核酸提取时，应充分悬浮磁珠，确保其均匀分散，同时合理控制离心的速度和时间，确保磁珠充分沉降。
核酸的分离与纯化讲解
• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
血浆核酸提取实验常见问题解析
血浆核酸提取实验常见问题解析很多人在做血液来源样本DNA提取时会对样本类型概念不清楚，所以在做核酸提取、核酸检测类的实验时，对提取试剂的选择比较随意，其实验结果也往往不尽如人意，那么不同血液来源的样本有什么区别，对核酸提取、核酸检测有什么影响呢？一、[endif]什么是外周血，什么是全血，什么是血清，什么是血浆？新鲜的血液（也叫全血，医学上称为外周血）加入抗凝剂（如柠檬酸钠，EDTA等，一般医院采血都是用抗凝管采集），静置一段时间，会出现分层的现象。
上面淡黄色的半透明液体是血浆，约占55%，下面暗红色不透明的是红细胞，约占45%。
中间薄薄的一层白色物质是白细胞和血小板，不到1%。
红细胞、白细胞、血小板共同组成了血细胞。
特别提示：不加抗凝剂的血液很快就会凝成血块，在凝血块周围出现的淡黄色的透明液体是血清，血清中不含纤维蛋白原。
简单来说，全血包括血浆和血细胞（红细胞、白细胞、血小板），血浆包括血清和纤维蛋白原。
在选择核酸提取试剂盒时，首先要考虑的是样本类型以及提取的核酸种类，选择针对性强，提取效率高的提取试剂盒。
如果要提取血细胞中的核酸，需要选择血细胞核酸提取试剂或全血核酸提取试剂；如果要从血清或血浆中提取游离核酸或游离肿瘤核酸则要选择血浆或血清核酸提取试剂；如果需要检测外周血中有无病毒或细菌感染，一般也是选择血浆或血清核酸提取试剂。
如果要提取DNA，需要选择DNA提取试剂，要提取RNA，则要选择RNA提取试剂。
如果目标基因丰度较低，需要较多的血浆或血清进行富集提取，则需要选择专门的血浆、血清核酸富集提取试剂。
还有，如果核酸检测的结果要面向临床出具检验报告，选择的提取试剂盒要通过药监局审查，应有药监局备案号，这一点非常重要。
在进行核酸提取实验时，切不可选错了试剂盒，否则会影响实验效果和实验进度。
目前，国内应用较多的血液系列核酸提取试剂主要有Qiagen、Biog等，其血液系列核酸提取试剂均比较全面，包括血细胞、血清、血浆、DNA、RNA、小量提取、中量富集提取等，研究者可根据实验需要进行选择。
1生物的核酸提取及常见的问题
DNase的抑制剂 DNase的抑制剂
加入少量金属离子螯合剂， 加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L Na或柠檬酸钠 DNase基本可以全部 或柠檬酸钠， EDTA2 Na或柠檬酸钠，DNase基本可以全部 失活。 失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase DNase失活。 DNase失活。 失活
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； Na2EDTA螯合 2+或Mn2+离子，抑制 螯合Mg 离子，抑制DNase活性； 活性； 螯合 活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中； 提供一个高盐环境， 充分溶解，存在于液相中； 充分溶解 CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜 β- 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，
线粒体和叶绿体：生物体内的半自主性细 线粒体和叶绿体： 胞器，自身可编码蛋白。 胞器，自身可编码蛋白。它们的比重和大 小一定，同一离心场内有确定的沉降速度。 小一定，同一离心场内有确定的沉降速度。 故可采用密度梯度离心的方法分离， 故可采用密度梯度离心的方法分离，使用 均匀介质（蔗糖、氯化铯等）。 均匀介质（蔗糖、氯化铯等）。
溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出， 注：CTAB溶液在低于 ℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物 溶液在低于 材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 ℃ 材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
CTAB抽提缓冲液的经典配方 CTAB抽提缓冲液的经典配方
核酸提取及常见问题分析
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
核酸提取及常见问题分析
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
核酸提取及常见问题分析
温灭菌 6. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免
核酸提取及常见问题分析
反复冻融
DNA提取常见问题
问题三：DNA提取量少。
原 因
1. 实验材料不佳或量少
2. 破壁或裂解不充分 对
3. 沉淀不完全
策
4. 洗涤时DNA丢失
1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料
2. 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
核酸提取及常见问题分析
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶核酸解提取及常见问题分析
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞， 使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
DNA提取的几种方法
非基因组DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
核酸提取及常见问题分析
基因组DNA－ CTAB法
DNA提取纯化用到的常见问题集
DNA提取纯化用到的常见问题集分享】DNA提取纯化用到的常见问题集Q1: 抽提DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?A1: 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。
经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。
而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%-15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA ，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA 。
所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。
也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿1:1混合使用。
Q2：为什么用酚与氯仿抽提DNA 时，还要加少量的异戊醇?A2：在抽提DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。
加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。
一般采用氯仿与异戊醇的比例为24:1。
也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为251，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
Q3：植物基因组DNA提取时遇到多糖成分的干扰，DNA提取纯化质量一直不高，如何消除多糖的影响？A3：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA 成胶冻状。
而CTAB DNA提取纯化法可基本上除去多糖。
如果是植物材料本身含糖量比较高，可尝试以下方法：1、在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。
可用缓冲液如：100 mmol/L Tris –HCl (pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol。
核酸提取及常见问题分析6
Q-3：回收DNA不能进行后续酶切实验？ ：回收 不能进行后续酶切实验？ 不能进行后续酶切实验 A-3：洗脱产物含有残留的乙醇会影响酶 ： 请确保彻底去除漂洗缓冲液， 切，请确保彻底去除漂洗缓冲液， Q-4：可否使用更小洗脱体积（小于说明 ：可否使用更小洗脱体积（ 书提供的最小洗脱体积） 书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提 高浓度？ 高浓度？ A-4：不可以，因为说明书提供的最少洗 ：不可以， 脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积， 脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积， 若再减少体积则不能将DNA完全洗脱下 若再减少体积则不能将 完全洗脱下 来。
根据片段大小选择 1 100bp以上的片段 以上的片段:TAKARA Agarose Gel 以上的片段 DNA Purification Kit Ver.2.0 Omega公司 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit 公司 从琼脂糖凝胶中回收DNA 从琼脂糖凝胶中回收 QIAGEN公司 MinElute Gel extraction kit 公司 北京博大泰克胶回收试剂盒， 北京博大泰克胶回收试剂盒，TIANGEN DNA产物纯化试剂盒都可以 产物纯化试剂盒都可以 2 100bp 以下的片段 以下的片段:QIAGEN公司 公司 MinElute Gel extration kit 可回收 bp可回收70 4kb的片段 的片段;QIAGEX II gel extraction kit, 的片段 可回收40 可回收 bp-50kb的片段 的片段 如果条带较暗说明DNA量较少，希望用较小体积的洗脱液以 如果条带较暗说明 量较少， 量较少 获得相对较高浓度的DNA，可使用 超薄型DNA产 获得相对较高浓度的 ，可使用TIANGEN 超薄型 产 物纯化试剂盒， 物纯化试剂盒，或QIAGEN公司 MinElute Gel extraction kit 公什么情况要从 片段， 片段 聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段？ 片段？ 聚丙烯酰胺凝胶中回收 片段 （1）当酶切产物与克隆载体大小相差很 ） 小时就需用到聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶， 小时就需用到聚丙烯酰胺凝胶，因为片 段相差不大时，琼脂糖凝胶不能分开， 段相差不大时，琼脂糖凝胶不能分开， 而聚丙烯酰胺能将相差几个bp的 而聚丙烯酰胺能将相差几个 的DNA片 片 段分开。 段分开。 （2）引物的纯化 ）
核酸提取纯化常见问题解答
核酸提取纯化常见问题解答1.AccuPrep®凝胶回收试剂盒常见问题2.AccuPrep®基因组DNA提取试剂盒常见问题3.AccuPrep®GMO提取试剂盒常见问题4.AccuPrep®PCR纯化试剂盒常见问题5.AccuPrep®质粒提取试剂盒常见问题6.AccuPrep®粪便DNA提取试剂盒常见问题7.AccuPrep®病毒RNA提取试剂盒常见问题8.琼脂糖凝胶回收和PCR纯化常见问题9.质粒DNA提取操作常见问题AccuPrep®凝胶回收试剂盒↑TOPQ1. 产量低A1. 1）凝胶不完全溶化会导致DNA产量的降低。
离液盐不足不仅会导致凝胶溶化不完全，DNA被包裹不能释放到溶液中，而且还降低柱子对DNA的亲和力，最终导致DNA产量降低。
2）加入等量的无水乙醇到W缓冲液中了吗? 过浓的W缓冲液会将DNA洗脱，从而导致产量的降低。
3）错误的洗脱缓冲液会降低产量. 洗脱缓冲也不能包含过多的盐. 缓冲液的pH 应调至7.0-8.5。
4）错误的结合条件例如pH过高会导致产量的降低GB缓冲液含有pH指示剂，当颜色为黄色时表示pH 在正常范围内。
如果颜色为红色或橘黄色，表示pH已经超出了正常的范围。
这时应该加入几滴醋酸钠溶液去调整pH值到正常范围内。
5）放入了过多的琼脂糖凝胶块。
如果放入了超过400mg的琼脂糖凝胶块可能会降低DNA结合柱的吸附力，从而导致DNA产量的降低。
Q2．琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中A2.琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中，这可能是因为样品中含有WB缓冲液。
WB缓冲液中的乙醇会导致悬浮，这种情况下离心样品三次。
如果悬浮的状况依然存在，那么打开盖子空气中放置10分钟挥发乙醇，再离心一次。
Q3．提纯后的后续酶反应效率降低A3. 1)样品中高浓度的盐抑制了酶的活性。
这种情况下，加入W缓冲液到结合柱后放置结合柱5分钟，然后再离心。
核酸提取与纯化
核酸提取与纯化引言核酸提取与纯化是生物学研究中常用的操作步骤之一。
核酸提取是指从生物样本中分离出DNA或RNA分子，纯化则是指将提取得到的核酸分子除去杂质，获得纯净的核酸样品。
本文将介绍核酸提取与纯化的基本原理、常用方法以及注意事项。
核酸提取原理核酸提取的基本原理是利用生物样本中DNA和RNA分子与其他组分（如蛋白质、细胞壁等）之间的化学或物理性质的差异，将核酸分子从样本中分离出来。
常见的提取方法有有机溶剂法、盐析法和离心法等。
有机溶剂法有机溶剂法是一种常用的核酸提取方法。
其原理是利用有机溶剂（如酚-氯仿混合液）与生物样本中的其他组分之间的亲和性差异，将核酸分子从样本中提取出来。
这种方法操作简单，适用于提取DNA和RNA。
具体操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞培养物或组织样本。
2.加入细胞裂解缓冲液，破坏细胞膜、核膜等结构，释放核酸分子。
3.加入酚-氯仿混合液，与细胞裂解液混合，形成两相体系。
4.离心分离两相，核酸分子会在有机相中分配到有机相中，而其他杂质会在水相中。
5.取出有机相，加入异丙醇或乙醇等沉淀剂，沉淀核酸分子。
6.离心沉淀，弃去上清液。
7.用乙醇洗涤沉淀，去除残留的盐和有机溶剂。
8.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
盐析法盐析法是利用核酸分子与盐溶液中的离子交互作用的原理进行分离。
该方法适用于高含量的核酸样本（如DNA或RNA）。
其操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入适量的盐溶液，使盐浓度达到一定程度。
3.离心分离沉淀，核酸分子会与高浓度盐溶液结合形成沉淀，而其他杂质会在上清液中。
4.取出沉淀，用盐溶液洗涤核酸，去除杂质。
5.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
离心法离心法是一种快速分离核酸的方法。
其原理是利用离心力将核酸分子从样本中沉淀下来。
离心法适用于小样本量和快速提取的情况。
具体步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入高盐缓冲液，增加核酸与其他组分之间的亲和性差异。
核酸分离和纯化
离心柱型
基因组DNA 提取步骤
裂解液+蛋白酶K 裂解细胞
缓冲液GB+乙醇 DNA柱子吸附
缓冲液GD 去除蛋白
漂洗液 漂洗DNA两次
洗脱液TE
洗脱DNA
41
4.1.4 DNA样品的进一步纯化
透析，沉淀，电泳，选择性沉淀
4.1.5 DNA片段的回收
原则：提高回收率，去除杂质污染 从琼脂糖凝胶中回收：
（2） 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使 氢键破坏，核蛋白解聚；
15
（3）酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中 的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使 水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异 戊醇=25：24：1）。
定体积水的石英比色杯中。
28
c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD
值
小分子杂质
核酸
蛋白质
d．计算浓度。
双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸 稀释倍数× 50/1000； RNA样品浓度(μg/μl)
= OD260×核酸稀释倍数×40/1000。
核酸定量仪
e．分析纯度。
RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、 耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中 的主要危害因素。0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯 ） 浸泡，器械180℃干烤8h。
8
④ 减少物理因素对核酸的降解，主要 是机械剪切力，其次是高温。
DNA提取及常见问题解决方案
石蜡玻片和包埋组织
应没有H.E染色
室温保存
核酸提取的一般过程
I.材料准备 材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放 破碎细胞或包膜－ 破碎细胞或包膜
提取
III.核酸分离、纯化 核酸分离、 核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 沉淀或吸附核酸， 沉淀或吸附核酸
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 核酸溶解在适量缓冲液或水中
重新纯化DNA， 重新纯化DNA，去 DNA 除蛋白、多糖、 除蛋白、多糖、多酚 等杂质 重新沉淀DNA， 重新沉淀DNA，让 DNA 酒精充分挥发 增加70％ 增加70％乙醇洗涤 70 的次数（ 的次数（2-3次）
2.
对 策
2.
3.
3.
问题二： 问题二：DNA降解 降解 原 因
1. 2.
1. 2. 3.
DNA提取中常见问题及解决方案
问题一： 样品不纯， 反应。 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和 样品不纯 抑制后续酶解和PCR反应。 反应 原因
1.
1.
DNA中含有蛋白、 DNA中含有蛋白、 中含有蛋白 多糖、多酚类杂质 多糖、 DNA在溶解前， DNA在溶解前，有 在溶解前 酒精残留， 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 DNA中残留有金属 离子
一、基因组DNA-CTAB法
（1）CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种 阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形 成复合物。 该复合物在高盐溶液（ Nacl ＞0.7mol/L ）是 可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多 糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸 分离出来。
核酸提取PCR荧光定量PCR常见问题解答
核酸提取、PCR、荧光定量PCR常见问题解答（百泰克）2014-05-10 14:27:44 来源：浏览次数：31 网友评论 0 条[核酸提取、PCR、荧光定量PCR常见问题解答（百泰克）] 第一部分核酸DNA和RNA提取常见问题分析1. RNAfixer的工作原理?浸入组织，抑制RNase的活性。
运输方便，是非液氮类的一种样品储存液。
2. 对于内源RNase丰富的组织和样品，如何消除RNase?可以在提取时候多加裂解液，比如 [荧光定量PCR 核酸提取 RT-PCR问题引物扩增效率反转录]第一部分核酸DNA和RNA提取常见问题分析1. RNAfixer的工作原理?浸入组织，抑制RNase的活性。
运输方便，是非液氮类的一种样品储存液。
2. 对于内源RNase丰富的组织和样品，如何消除RNase?可以在提取时候多加裂解液，比如4：1等。
3. TRIpure and RNApure区别?胍盐类的裂解液一样，RNApure附加有离心柱，和漂洗液，是Kit。
TRIpure只是裂解液。
4. 凝血的gDNA和RNA的提取与新鲜血的提取不同?需加一个分离柱(separate column)分开凝血。
5. micrornA提取和定量?过2次离心柱，得到200bp一下的小rna。
可以测定OD定量。
6. 血清，血浆，血液RNA提取的区别?以及Viral RNA提取的方法?液体类样品RNA提取用TRIpure LS。
一般血清、血浆是无细胞样品，含游离的RNA，量比较少，建议加Carrier RNA在提取时候。
病毒RNA提取最好加Carrier RNA在提取时候，BioTeke有专门的病毒RNA提取试剂盒。
7. 通用植物RNA提取常见问题：蛋白质污染?DNA污染-DNaseI消化(Kit does not provide it, please get it from other companies.)8. 真菌RNA提取可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit。
核酸抽提的一些基础知识解答.doc
核酸抽提的基础近日撰写了一个关于核酸抽提的基础现状的草稿；没有去找参考书润色，所以会有点凌乱。
首先声明的是：这篇东西只为有一定核酸抽提基础知识的人准备，同时也将会及时修改。
那些分子生物学的过客，最好不要看本文；一是我的思维有点跳跃，二则是没有必要糟蹋自己的时间。
写这篇东西的另外一个原因是，我一直在思考如何简化经典的无介质的核酸抽提程序。
最经典的是裂解一步，去蛋白质一步，核酸沉淀一步；DNAzol 将这三步并成了一步，按道理已经简化到了极致。
事实是，DNAzol 并没有被大家认可，其原因大概还是质量不太可靠吧。
现在也有使用Proteinase K 消化后直接沉淀核酸的方法，三步简化成了两步，可我总觉得醇的沉淀不可能彻底去除Proteinase K。
明年大概还没有生物学的诺贝尔奖会花落中国的，那么先求得一个核酸抽提最简单的非介质方法世界领先如何？一笑！也一定。
1、核酸抽提原理简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。
裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等）和盐（如Tris、EDTA、NaCl 等）。
盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境（如Tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸结构的稳定（如NaCl）等。
去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。
裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。
也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如GIT、GuHCl 等）裂解的，该方法已经成为了RNA 抽提的主流，却不是DNA 抽提的主流。
最常用的纯化方法，一是PC 抽提+ 醇沉淀，二是介质纯化。
核酸提取及常见问题分析——王伟
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。
原因
1. 材料丌新鲜、反复冶
1. 尽量取新鲜材料，低温保
融或细胞衰老冶融或 细胞衰老 2. 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 3. 外源核酸酶污染
对 策
存避免反复冶融 2. 可增加裂解液中螯合剂的 含量 3. 细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔 4. 所有试剂用无菌水配制， 耗材经高温灭菌 5. DNA分装保存于缓冲液 ，避免反复冶融
测定结果分析
测DNA：
纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／ OD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小 分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的 情冴。
当沉淀时间有限时，用预况的乙醇或异丙醇 沉淀，沉淀会更充分 。
沉淀后应用70％乙醇洗涤，以除去盐离子等
晾干DNA，让乙醇充分挥发（丌要过分干燥）
样本保存和前处理
• 抗凝血液
• 非抗凝血 • 微量血液/干血点 • 口拭子/漱口水
样本保存和前处理－抗凝血液
• 保存: 柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶 反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,使用柠檬 酸或EDTA处理血样。 加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月； －70℃长期保存。 尽可能保证样本丌经过反复冶融！ • 样本前处理: 1. 冶存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。 2. 抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。
核酸提取及常见问题分析
A-6：聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶不同，其采用 胶浸泡液回收凝胶内DNA，而非溶胶液，胶块本身 就不会溶解。 Q-7：电泳检测只有一条目的带，可否选用凝胶回 收试剂盒？ A-7：可以，如果后续实验对片段纯度要求较高， 建议即使只有一条用，也可以切胶纯化，其回收得 到片段的纯度可能要比值接回收高一些。 Q-8：琼脂糖凝胶胶块不溶？ A-8：1．琼脂糖质量不好．２．含目的片段的凝胶 再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶 后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20 ℃ 。 3．制胶的电泳缓冲液浓度高或陈旧。
北京博大泰克公司，所有的公司中的产品中最便宜， 效果还不错，试剂盒中的各种成分可单独购买
北京TIANGEN公司（又名天根生化），原名北京天为时代， 2005年与德国QIAGEN建立合作，挂名其子公司，所以改 名TIANGEN公司，技术上借鉴了QIAGEN，产品性能与其 接近，而价格便宜得多。 其他公司：国外：美国promega, invitrogen, clontech，加拿大BBI等 国内：长沙安比奥生物，江苏碧云天，上海生工， 上海申能博彩等 可以酌情选用。
利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到 目的片段？ A-5：可能有以下几个原因： 1．胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增 加上下颠倒次数辅助溶解； 2．胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回 收； 3．电泳缓冲液PH太高，硅基质膜在高盐低PH结 合DNA，如PH太高， 应作适当调整； 4．漂洗液中未加入无水乙醇。 Q-6：为什么聚丙烯酰胺凝胶加入d Mega Kit(质粒可转细 菌,酵母) QIAfilter PlasmidmMega Kit(质粒可转细 胞) （2）100bp 以下的片段胶回收: MinElute Gel extration kit 可回收70 bp4kb的片段; QIAGEX II gel extraction kit,可回收40 bp-50kb的片段
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
核酸提取纯化常见问题解答1.AccuPrep®凝胶回收试剂盒常见问题2.AccuPrep®基因组DNA提取试剂盒常见问题3.AccuPrep®GMO提取试剂盒常见问题4.AccuPrep®PCR纯化试剂盒常见问题5.AccuPrep®质粒提取试剂盒常见问题6.AccuPrep®粪便DNA提取试剂盒常见问题7.AccuPrep®病毒RNA提取试剂盒常见问题8.琼脂糖凝胶回收和PCR纯化常见问题9.质粒DNA提取操作常见问题AccuPrep®凝胶回收试剂盒↑TOPQ1. 产量低A1. 1）凝胶不完全溶化会导致DNA产量的降低。
离液盐不足不仅会导致凝胶溶化不完全，DNA被包裹不能释放到溶液中，而且还降低柱子对DNA的亲和力，最终导致DNA产量降低。
2）加入等量的无水乙醇到W缓冲液中了吗? 过浓的W缓冲液会将DNA洗脱，从而导致产量的降低。
3）错误的洗脱缓冲液会降低产量. 洗脱缓冲也不能包含过多的盐. 缓冲液的pH 应调至7.0-8.5。
4）错误的结合条件例如pH过高会导致产量的降低GB缓冲液含有pH指示剂，当颜色为黄色时表示pH 在正常范围内。
如果颜色为红色或橘黄色，表示pH已经超出了正常的范围。
这时应该加入几滴醋酸钠溶液去调整pH值到正常范围内。
5）放入了过多的琼脂糖凝胶块。
如果放入了超过400mg的琼脂糖凝胶块可能会降低DNA结合柱的吸附力，从而导致DNA产量的降低。
Q2．琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中A2.琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中，这可能是因为样品中含有WB缓冲液。
WB缓冲液中的乙醇会导致悬浮，这种情况下离心样品三次。
如果悬浮的状况依然存在，那么打开盖子空气中放置10分钟挥发乙醇，再离心一次。
Q3．提纯后的后续酶反应效率降低A3. 1)样品中高浓度的盐抑制了酶的活性。
这种情况下，加入W缓冲液到结合柱后放置结合柱5分钟，然后再离心。
2)样品中含有残留的WB缓冲液，残留的乙醇会抑制后续的酶反应，结合柱必须要完全晾干。
如果问题仍然存在, 第二次离心后让结合柱晾干10分钟。
3）一起被洗脱的玻璃纤维影响了酶的活性，再离心1分钟，转移上清液到一个新的离心管中。
AccuPrep® 基因组DNA提取试剂盒↑TOPQ1. DNA产量或纯度低A1. 1）缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。
确保试剂到货后存放于室温(15-25℃)，试剂使用后瓶盖要拧紧，保持其pH值及稳定性，避免污染。
冻干试剂溶解后应分装并于–20℃保存。
2）在洗涤缓冲液1和2中没有加入无水乙醇。
加入乙醇后，充分混匀洗涤缓冲液W1和W2，并且作标记，表明乙醇己加入。
3）试剂和样本没有充分混匀。
每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。
4）您可能没有选用适合的试剂来洗脱DNA。
洗脱DNA需要碱性条件，使用试剂盒中提供的洗脱缓冲液进行洗脱。
5）裂解可能不完全。
确保裂解液从混浊变的澄清，表明蛋白质已经降解。
根据组织类型不同需要的裂解时间会有差异。
裂解通常需要1-3小时，为保证其效率，可以使用振荡水浴的方法（如实验操作中所述）。
样品中加入蛋白酶Ｋ后要立即混匀。
裂解液加入结合柱前将样品与异丙醇充分混匀。
6）从组织中提取的产量低。
在进行消化与裂解步骤之前确保组织破碎为小块（或粉末状），以下两步增加了与蛋白酶Ｋ一起孵育的时间：A 将组织与蛋白酶Ｋ孵育过夜。
B. 将组织与蛋白酶Ｋ孵育3 ~ 4小时，然后加入新鲜的蛋白酶Ｋ30 µl再孵育1 ~ 2小时。
7）产物在260nm处的吸光值(A260)太高。
结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。
这些纤维可以将光散射，造成了较高的吸光值读数。
在最后的洗脱阶段，太多的离心也可能导致将结合柱中的玻璃纤维洗脱下来，除去玻璃纤维的方法如下面所述。
Q2.提取的DNA不能够被酶切或酶切完全A2. 结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。
这些纤维会抑制酶切反应。
最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心１分钟，可以在管底看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸出原来管中的玻璃纤维即可。
Q3．组织样本中的DNA降解A3. 获得的组织样本应立即-20°C 冷冻保存，直至开始裂解步骤。
使用研钵和研棒在液氮作用下将组织研磨成粉末，在没有裂解的组织中可能有核酸酶活性。
Q4．血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色A4. 结合柱可能洗涤不充分，应洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200 µl洗脱液与200 µl GC缓冲液混合，再加入100 µl 异丙醇，重复纯化步骤。
Q5．在某些缓冲液中有白色沉淀(TL 或GC缓冲液)A5. 经过在低温下的长期存放，组织裂解缓冲液或结合缓冲液中可能出现白色沉淀。
在60°C孵育可使沉淀溶解。
沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。
AccuPrep® GMO提取试剂盒↑TOPQ1. DNA 产量或纯度低A1. 1) 试剂盒保存条件不适当。
到货后存于15-25℃。
2) 缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。
确保试剂到货后存放于室温(15~25°C)，试剂使用后瓶盖要拧紧，保持其pH值及稳定性，避免污染。
冻干试剂溶解后应分装并于2 ~ 8℃或-15 ~ -25℃保存。
3) 使用前在洗涤缓冲液中没有加入无水乙醇。
加入乙醇后充分混匀并存于15 ~ 25℃。
做标记标明是否已加入。
4) 试剂和样本没有充分混匀。
每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。
Q2.DNA洗脱回收率低A2.可能使用了不适当的洗脱缓冲液。
不要用水洗脱，请用试剂盒中提供的洗脱缓冲液洗脱。
Q3. 提取的DNA不能够被酶切或酶切完全A3. 结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。
这些纤维会抑制酶切反应。
最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心１分钟，可以在管低看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸出原来管中的玻璃纤维即可。
Q4. 产物在260nm处的吸光值(A260)太高A4. 结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。
这些纤维可以将光散射，造成了较高的吸光值读数。
除去玻璃纤维的方法如上所述。
Q5. DNA产量低A5. 1) 蛋白酶K溶解不完全。
按照下面步骤完全溶解蛋白酶K:1.吸取2.5ml双蒸水加入蛋白酶K冻干粉小瓶中。
2.盖上瓶盖，颠倒几次使蛋白酶K完全溶解。
3.分装并做标记，存于–15 to -25°C。
注意: 按照此种方法溶解的蛋白酶K至少可稳定存放12个月。
2) 裂解不完全。
加入蛋白酶K后立即将样本混匀。
裂解液加入结合柱前要与异丙醇彻底混匀。
Q6. 从组织中提取产量低A6. 蛋白酶K消化不完全。
确保消化与裂解步骤之前组织破碎成小块。
有两种方法增加孵育时间：.组织与蛋白酶K一起孵育过夜, 或孵育蛋白酶K 3~4小时，再加入30 μL蛋白酶K 温育1~2小时。
Q7. 组织样本中的DNA降解A7. 在没有裂解的组织中存在核酸酶活性。
组织在进行裂解步骤前应该冻存于-20 °C，样品进行匀质化时使用小块组织(20-40 mg)。
Q8. 血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色A8. 结合柱可能洗涤不充分，应洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200 µl洗脱液与400 µl 结合缓冲液混合，再加入100 µl 异丙醇，重复纯化步骤。
Q9. 在PL缓冲液和B缓冲液中有白色沉淀A9. 经过在低温下的长期存放，PL缓冲液或B缓冲液中可能出现白色沉淀。
在70°C孵育可使沉淀溶解。
沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。
AccuPrep® PCR纯化试剂盒↑TOPQ1. 低产量A1. 1. 您是否将PCR产物与结合缓冲液充分混匀？不足浓度的离液盐不会增加DNA与结合柱的吸附。
2. 您是否在洗涤缓冲液中加入了足量的无水乙醇？浓缩的洗涤缓冲液可以洗去结合的DNA。
3. 使用不正确的洗脱缓冲液可能会降低产量。
洗脱缓冲液不能含有太多盐离子，最适pH值应为7.0-8.5。
Q2. 样品在琼脂糖凝胶中上样后漂浮A2. 样品可能包含残留的洗涤缓冲液因而导致漂浮。
必须离心确保柱子中没有挂壁的液滴。
如果这种情况持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10 min，然后再进行洗脱。
Q3. 后续酶切反应不正常A3. 1. 样品中高浓度的盐离子会抑制酶切反应，这种情况下，应在结合柱中加入洗涤缓冲液后静置5 min,再离心。
2. 样品中包含残留的洗涤缓冲液，残留的乙醇影响酶切反应的进行，结合柱必须完全干燥。
如果这种情况持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10 min，然后再进行洗脱。
3. 玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性，离心1min将上清转移至一个新管即可。
AccuPrep® 质粒提取试剂盒↑TOPQ1. 质粒产量低A1. 1. 您是否收集了足够数量的细胞?产量依赖于宿主菌型，细胞过量也可能会使产量降低.请参阅附录。
2. 您是否使用了重悬缓冲液充分悬浮细胞？不完全重悬浮细胞会降低裂解效率。
3. 中和缓冲液中是否有盐沉淀？涡旋振荡重新使沉淀溶解。
离液盐浓度不适当会导致产量的降低。
如果沉淀不易溶解，可于60℃加热。
4. 加入RNase A 干粉后试剂是否保存超过了６个月？低浓度的RNase A可以导致质粒产量低，６个月后，再加入一些RNase A，至多达到100 µg/µl。
Q2. 染色体DNA污染(电泳分析时出现了杂带)A2. 在第三步，样品不能够涡旋和剧烈振荡，裂解时间不能超过５分钟，这些都可能切断染色体DNA，轻柔处理裂解液。
Q3. 进行琼脂糖凝胶电泳上样时样品漂浮A3. 样品含有残留乙醇导致了漂浮，离心后必须使柱子完全干燥，确保结合柱内无挂壁液滴。
Q4. 序列分析时有许多背景条带A4. 您是否检查了宿主E. coli菌株的内切酶活性？HB101, JM系列及正常野生型宿主有很高内切酶活性，通过降解质粒干扰测序反应。
对于这些类型，需要第七步变性过程。
Q5. 样品中含有RNAA5. 1. 收集细胞的量过多。
我们推荐使用适当的量，根据附录中显示的宿主细胞光密度。
2. RNase活性减弱。
RNase A干粉加入到重悬缓冲液中保存超过6个月以上，RNase活性会减弱，需再加入一些RNase A干粉，多至100 µg/µl。
Q6. 玻璃纤维的洗脱A6. 玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性，以最大速度离心1min，上清转移至一个新管即可。
AccuPrep® 粪便DNA提取试剂盒↑TOPQ1. 提取后DNA纯度过低A1. 1. 试剂盒的储存条件不正确。