酶联免疫吸附测定法elisa法
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固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
医学ppt
14
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
医学ppt
15
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
医学ppt
12
（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
医学ppt
13
包被固相载体: 用已知抗原包被
生物体系中的化学测量
酶联免疫吸附测定法
裴丹青03081152
医学ppt
1
复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示 生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和 预防的过程中也日益凸现其重要作用。
经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、 简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测 对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂 且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。
医学ppt
4
一、基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
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5
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上， 但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原） 与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保 留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体 上的抗原（抗体）反应结合后，
用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
医学ppt
分别洗涤 除去未结合
的成分
16
对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶 标抗原与固相抗体竞争结合的结果而 异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上 结合的酶标抗原量减少。因此，加入 底物后显色反应较弱。
葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
黄色 405 深蓝色 420
β-Ｄ－半乳糖 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)
苷酶
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
荧光 黄色
360,450 420
医学ppt
9
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
例如，在测定血清中某一物质的含量时， 化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应 测定法的敏感度约为5~10μg/ml 。
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18
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
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10
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
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11
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
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17
特点一：灵敏性
该测定法的灵敏度来自作为报告集团的 酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少 量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可 供观察的显色反应现象。因此该体系常被称 为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细 胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在 微克、甚至纳克水平上对其进行定量。
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19
例如乙肝病毒中的 表面抗原（HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和核心抗 体（HBcAg），虽来源于 同一病毒，但仅与其相 应的抗体结合，而不与 另外两种抗体反应。抗 原抗体反应的这种特异 性使免疫测定能在一非 常复杂的蛋白质化合物 （例如血清）中测定某 一特定的物质，而不需 先分离待检物。
于是，一系列针对生物体系中化学成分的测 量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它 将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体 系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。
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2
什么是 酶联免疫分析技术 ELISA的基本原理和方法 ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例
医学ppt
3wk.baidu.com
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷
兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免 疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领 域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分 析方法，是在免疫酶技术 ( immunoenzymatic techniques ) 的基础 上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。
再加上酶 的相应底 物，即起 催化水解 或氧化还 原反应而 呈颜色。
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6
其所生成的颜色深浅与 欲测的抗原（抗体）含量成 正比。
这种有色产物可用肉眼、 光学显微镜、电子显微镜观 察，也可以用分光光度计 （酶标仪）加以测定。
其方法简单，方便讯速， 特异性强。
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7
二、酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
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8
酶
底物
显色 测定波长
反应
辣根过氧化物酶 邻苯二胺
橘红色 492
四甲替联苯胺
黄色 460
氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
棕色 兰色 蓝绿色
449 425 642
唑啉磺酸-6)铵盐
碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
黄色 400 红色 500
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
医学ppt
14
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
医学ppt
15
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
医学ppt
12
（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
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包被固相载体: 用已知抗原包被
生物体系中的化学测量
酶联免疫吸附测定法
裴丹青03081152
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1
复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示 生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和 预防的过程中也日益凸现其重要作用。
经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、 简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测 对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂 且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。
医学ppt
4
一、基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
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测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上， 但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原） 与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保 留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体 上的抗原（抗体）反应结合后，
用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
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分别洗涤 除去未结合
的成分
16
对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶 标抗原与固相抗体竞争结合的结果而 异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上 结合的酶标抗原量减少。因此，加入 底物后显色反应较弱。
葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
黄色 405 深蓝色 420
β-Ｄ－半乳糖 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)
苷酶
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
荧光 黄色
360,450 420
医学ppt
9
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
例如，在测定血清中某一物质的含量时， 化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应 测定法的敏感度约为5~10μg/ml 。
医学ppt
18
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
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（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
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11
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
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特点一：灵敏性
该测定法的灵敏度来自作为报告集团的 酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少 量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可 供观察的显色反应现象。因此该体系常被称 为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细 胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在 微克、甚至纳克水平上对其进行定量。
医学ppt
19
例如乙肝病毒中的 表面抗原（HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和核心抗 体（HBcAg），虽来源于 同一病毒，但仅与其相 应的抗体结合，而不与 另外两种抗体反应。抗 原抗体反应的这种特异 性使免疫测定能在一非 常复杂的蛋白质化合物 （例如血清）中测定某 一特定的物质，而不需 先分离待检物。
于是，一系列针对生物体系中化学成分的测 量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它 将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体 系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。
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2
什么是 酶联免疫分析技术 ELISA的基本原理和方法 ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例
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1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷
兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免 疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领 域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分 析方法，是在免疫酶技术 ( immunoenzymatic techniques ) 的基础 上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。
再加上酶 的相应底 物，即起 催化水解 或氧化还 原反应而 呈颜色。
医学ppt
6
其所生成的颜色深浅与 欲测的抗原（抗体）含量成 正比。
这种有色产物可用肉眼、 光学显微镜、电子显微镜观 察，也可以用分光光度计 （酶标仪）加以测定。
其方法简单，方便讯速， 特异性强。
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二、酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
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8
酶
底物
显色 测定波长
反应
辣根过氧化物酶 邻苯二胺
橘红色 492
四甲替联苯胺
黄色 460
氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
棕色 兰色 蓝绿色
449 425 642
唑啉磺酸-6)铵盐
碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
黄色 400 红色 500